人和鼠肝微粒体药物代谢检测平台的建立及初步应用研究

发布时间：2017-03-21 10:03

  本文关键词：人和鼠肝微粒体药物代谢检测平台的建立及初步应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】： 肝脏是人体重要的生物转化场所,肝细胞的光面内质网(sER)上镶嵌着丰富的代谢酶,负责内源及外源化合物的代谢。这其中包括主要的Ⅰ相药物代谢酶:细胞色素P450(CYP)及黄素单氧化酶(FMO)。破碎肝细胞后,制备人肝脏微粒体(HLM),其上保留着这些酶。因此HLM可以用来进行体外的药物代谢研究,包括ⅰ).CYP反应表型研究;ⅱ).基于CYP的药物相互作用研究,以及代谢稳定性的研究。药物代谢的体外和体内研究数据有一定的相关性,体外研究有助于解释临床数据,可用于评价药物在人体内潜在的代谢情况。采用体外研究早期发现人体内药物代谢的途径和产物,可以为临床前研究提供明确的方向。本研究的目的是建立体外药物代谢研究用的人和鼠肝微粒体药物代谢模型,并对其应用进行初探。 首先用改良后的Omura法,制备SD大鼠和混合人肝微粒体。制备好的人、鼠肝微粒体经一氧化碳还原示差法对P450酶含量进行测定。之后用荧光检测技术检测肝微粒体对荧光底物CEC、DBF、AMMC和EFC的代谢情况,初步判断肝微粒是否具有P450酶催化活性。定量结果显示制备的人、鼠肝微粒体在450nm有明显的吸收峰,测得P450酶含量分别为593±27pmol/mg和964.67±32pmol/mg。通过与四种荧光底物进行多次酶活性检测。除了EFC底物无明显催化活性,人肝微粒体对AMMC的催化活性较弱外,人肝和鼠肝微粒体均可以与CEC、DBF底物作用,呈现出明显而稳定的催化活性,在一定范围内荧光信号随着酶浓度增大而增大,随着时间的延长而增强。 其次用高效液相色谱技术进一步评价肝微粒体药物代谢检测平台的可靠性,将肝微粒体与特异性探针底物bufuralol、coumarin、s-mephenytoin和nifedipine反应,分析生成的产物,计算K_m、V_(max)值,根据CL_(int)=V_(max)/K_m计算内在清除率。同时用2D6、2A6、2C19和3A4特异性抑制剂奎宁丁、反苯环丙胺及酮康唑对人、鼠肝微粒体进行抑制实验,察看抑制效应强弱,求解IC_(50)值。结果显示:鼠肝微粒体对探针底物bufuralol和nifedipine有显著的催化活性,而对coumarin和s-mephenytoin无代谢;人肝微粒体则对四种特异性探针底物均有明显而稳定的催化活性,所求得的K_m、V_(max)和CL_(int)值也与文献报道的相符。特异性抑制剂对鼠肝微粒体均无抑制效应,而对人肝微粒体则显示出了较强的抑制效应,IC_(50)值较小。 通过多方面的比较,证明了本研究建立的人、鼠肝微粒体体外药物代谢平台的可行性和可靠性。荧光检测和高效液相色谱检测结果表现出一致性。活性测定结果和抑制作用检测结果表明了人、鼠肝微粒体可用于CYP450酶及其相关药物代谢研究的体外模型,使实验结果相互验证。在人肝微粒体与重组人细胞色素P450酶比较中,证明了采用酶反应活性测定及其选择性抑制作用测定的结合模式具有科学性。总之本研究成功建立了人、鼠肝微粒体药物代谢检测平台,并对其应用进行了初探。
【关键词】：人肝微粒体 鼠肝微粒体 细胞色素P450 酶动力学分析 荧光检测技术 高效液相色谱检测技术
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 英文缩略语表11-12
• 前言12-14
• 第一章 文献回顾14-29
• 1 药物代谢的研究进展14-19
• 1.1 药物代谢的过程及研究进展14-15
• 1.2 药物代谢的场所15
• 1.3 药物代谢酶系统15-16
• 1.4 影响药物代谢的因素16-19
• 1.4.1 种属差异16-17
• 1.4.2 个体差异17-18
• 1.4.3 药物相互作用18-19
• 2 人肝细胞色素P450及其在药物代谢中作用的研究进展19-27
• 2.1 CYP450的命名与分布19-20
• 2.2 CYP450在药物代谢中的作用及其功能成份20-21
• 2.3 CYP450酶的遗传多态性21-22
• 2.4 与CYP450有关的体外药物代谢研究方法进展22-25
• 2.4.1 肝微粒体体外代谢法22-23
• 2.4.1.1 肝微粒体的用途22-23
• 2.4.1.2 肝微粒的模型特点23
• 2.4.2 肝细胞体外代谢法23-24
• 2.4.3 肝切片法24
• 2.4.4 离体肝灌流法24
• 2.4.5 重组CYP450酶24-25
• 2.5 与CYP450有关的药物代谢检测方法进展25-26
• 2.5.1 色谱检测技术25-26
• 2.5.2 放射性检测技术26
• 2.5.3 荧光检测技术26
• 2.5.4 生物发光检测技术26
• 2.6 CYP450药物代谢系统的评价方法26-27
• 2.6.1 代谢稳定性评价方法26-27
• 2.6.2 CYP450酶抑制的评价方法27
• 2.6.3 CYP450酶诱导的评价方法27
• 3 CYP450药物代谢研究的展望27-29
• 第二章 大鼠和人肝微粒体药物代谢检测平台的建立及初步评价29-41
• 1 材料29-31
• 1.1 肝组织材料29
• 1.1.1 大鼠肝组织材料29
• 1.1.2 人肝组织材料29
• 1.2 试剂29-30
• 1.3 主要溶液30
• 1.4 主要仪器30-31
• 2 方法31-33
• 2.1 鼠肝微粒体的制备及鉴定31-32
• 2.1.1 样品的处理31
• 2.1.2 肝微粒体的制备31
• 2.1.3 肝微粒体浓度的测定31
• 2.1.4 肝微粒体中P450含量的测定31-32
• 2.1.5 肝微粒体制备条件的优化32
• 2.1.6 荧光检测技术测定大鼠肝微粒体中P450酶活性32
• 2.2 人肝微粒体的制备及鉴定32-33
• 2.2.1 肝脏的采集32-33
• 2.2.2 样品的处理33
• 2.2.3 肝微粒体的制备33
• 2.2.4 肝微粒体浓度的测定33
• 2.2.5 肝微粒体中P450含量的测定33
• 2.2.6 荧光检测技术测定人肝微粒体中P450酶活性33
• 3 结果33-37
• 3.1 大鼠肝微粒的制备及测定结果33-36
• 3.1.1 BSA标准曲线绘制33-34
• 3.1.2 鼠肝微粒体中P450含量的测定34-35
• 3.1.3 荧光检测技术测定鼠肝微粒体中P450酶活性35-36
• 3.2 人肝微粒的制备及测定结果36-37
• 3.2.1 BSA标准曲线绘制36
• 3.2.2 人肝微粒体中P450含量的测定36-37
• 3.2.3 荧光检测技术测定鼠肝微粒体中P450酶活性37
• 4 讨论37-41
• 4.1 肝微粒体模型的建立38-39
• 4.2 肝微粒体模型的初步评价39-41
• 4.2.1 P450酶含量的测定39-40
• 4.2.2 P450活性的初步检测40-41
• 第三章 HPLC检测技术鉴定人、鼠肝微粒体药物代谢检测平台及其应用研究的初探41-58
• 1 材料41-42
• 1.1 肝微粒体41
• 1.2 主要试剂41-42
• 1.3 主要溶液42
• 1.4 主要仪器42
• 2 方法42-49
• 2.1 高效液相色谱技术测定大鼠肝微粒体中P450酶活性42-46
• 2.1.1 用Bufuralol(2D6底物)测定鼠肝微粒体中2D6酶活性42-44
• 2.1.2 用Coumarin(2A6底物)测定鼠肝微粒体中2A6酶活性44-45
• 2.1.3 用S-Mephenytoin(2C19底物)测定鼠肝微粒体中2C19酶活性45
• 2.1.4 用Nifedipine(3A4底物)测定鼠肝微粒体中3A4酶活性45-46
• 2.2.高效液相色谱技术测定人肝微粒体中P450酶活性46-49
• 2.2.1 用Bufuralol(2D6底物)测定人肝微粒体中2D6酶活性46-47
• 2.2.2 用Coumarin(2A6底物)测定人肝微粒体中2A6酶活性47-48
• 2.2.3 用S-Mephenytoin(2C19底物)测定人肝微粒体中2C19酶活性48-49
• 2.2.4 用Nifedipine(3A4底物)测定人肝微粒体中3A4酶活性49
• 3 结果49-54
• 3.1 各探针底物标准曲线的建立49-50
• 3.2 鼠肝微粒体与各底物反应时间和酶浓度的优化50
• 3.3 人肝微粒体与各底物反应时间和酶浓度的优化50-51
• 3.4 鼠肝微粒体与各底物反应酶动力学参数的计算51
• 3.5 人肝微粒体与各底物反应酶动力学参数的计算51-52
• 3.6 各特异性抑制剂对鼠肝微粒体的抑制及IC_(50)52-53
• 3.7 各特异性抑制剂对人肝微粒体的抑制及IC_(50)53-54
• 4 讨论54-58
• 4.1 HPLC与荧光检测方法的比较54
• 4.1.1 色谱检测技术与荧光检测技术的比较54
• 4.1.2 色谱检测与荧光检测结果的比较54
• 4.2 HLM和RLM药物代谢模型的比较54-56
• 4.2.1 酶动力学参数的比较55
• 4.2.2 抑制效应(IC_(50))的比较55-56
• 4.3 HLM和重组P450酶药物代谢模型的比较56-57
• 4.3.1 酶动力学参数的比较56-57
• 4.3.2 抑制效应(IC_(50))的比较57
• 4.4 实验数据与报道文献的比较57
• 4.5 小结57-58
• 全文小结58-60
• 1 结论58-59
• 2 今后工作展望59-60
• 附录60-67
• 参考文献67-76
• 致谢76

【引证文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王芳;李艳丽;郑文;许卉;;硝苯地平探针高效液相色谱法测定大鼠肝微粒体CYP3A酶活性[J];烟台大学学报(自然科学与工程版);2013年02期

中国硕士学位论文全文数据库 前5条

1 李晶;没食子酸冰片酯在肝微粒体中的代谢研究[D];西北大学;2011年

2 孙坤;青蒿素类抗疟药与药物代谢酶相互作用研究[D];山西医科大学;2011年

3 王鹏;蒙古黄芪中皂苷类成分提取工艺及其体外代谢的初步研究[D];山西医科大学;2010年

4 唐维;白藜芦醇在大鼠体内的药代动力学及其对CYP1A1酶活性的影响[D];华中科技大学;2011年

5 杨樱;不同种属动物肝微粒体CYP450酶对钩吻代谢的影响[D];福建中医药大学;2013年

  本文关键词：人和鼠肝微粒体药物代谢检测平台的建立及初步应用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：259435