不同结构褐藻胶及其系列衍生物的制备与活性研究

发布时间：2017-03-29 07:08

  本文关键词：不同结构褐藻胶及其系列衍生物的制备与活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本论文从三株褐藻：海茸（Durvillaea antarctica），变黑雷松藻（Lessonianigrescence），螺纹雷松藻(Lessonia trabeculata)分别用热水提和碱提得到8种褐藻胶，并对其进行了理化性质和结构分析，核磁共振氢谱（1H-NMR）分析表明，TCA1的古洛糖醛酸含量在90%以上，AWA1的甘露糖醛酸含量在80%以上。通过酸降和微波酸降得到12种降解的褐藻胶，制得了分子量从3-110KDa，M/G值从0.1-9的20种系列结构不同的褐藻胶。由于当褐藻胶中G含量超过70%时具有较高的力学强度，最低的皱缩，高孔隙率以及在一价离子溶液中有较高的稳定性的特性，本研究以TCA1（MW=80KDa；FG=91%）为原料制作了包有微生物的微球，微囊粒径在0.5-5.0mm（微囊的粒径可以控制），在大规模制备和回收方面有较大的优势，并保证了细胞的活性。 三氮杂环类化合物具有强的抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤等活性，抗病毒药物利巴韦林、抗真菌药物氟康唑均是成功应用于临床的三氮唑类化合物。本论文对制备的20种系列褐藻胶进行三氮唑环修饰最终制得了40种褐藻胶的三氮唑环衍生物，首先通过利用EDC、NHS制备褐藻胶-PEG-N3b，在此反应中EDC的用量是影响产率的一个重要原因，当EDC与海藻胶的质量比为117/50时，修饰度达到11%左右，最适反应条件是：室温、60min、pH值在4-6之间。 褐藻胶-PEG-N3b分别与丙炔酸甲酯以及3-乙炔基噻吩通过点击反应制备了羧甲基三氮唑-PEG-褐藻胶和3-噻吩并三氮唑-PEG-褐藻胶，并对常规法和微波辅助合成法进行了比较，常规合成法在70℃下反应12h产率达到100%而微波合成只需在100W、80℃下反应15min产率就能达到100%。 本文对制备的系列褐藻胶衍生物进行抗弧菌和抗病毒活性评价，结果表明羧基是抗病毒活性的促进基团，而三氮唑环的引入可以使得活性增强，3-噻吩并三氮唑-PEG-褐藻胶中既存在三氮唑基团同时又有噻吩基团，活性进一步提高说明噻吩环同样是抗病毒活性的促进基团，褐藻胶的分子量和M/G值同样影响抗病毒活性，在分子量4KDa高M含量的褐藻胶的抗病毒活性最强，抑制率达到70%；衍生物抗菌活性评价：以三种水产致病菌鳗弧菌（V．anguillarum）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）、副溶血弧菌（V.Parahaemolyticus）为供试菌，研究发现不同聚合度、不同M/G值抗菌能力不同，其中分子量在3KDa的高G褐藻胶衍生物具有最高的抗菌活性，修饰基团中的三氮唑基团和噻吩基团对三种弧菌均产生较好的抗性，并且褐藻胶衍生物中3-噻吩并三氮唑-PEG-褐藻胶抗菌活性稍高。因此类衍生物安全性高、无毒的特点，有望作为水产药物应用于水产养殖业。 本研究通过还原、氧化、氨化、硫酸化反应制得了20种褐藻胶类肝素衍生物，结果发现，衍生物MG1E、MG5E、MG2E、G2E的APTT值与能够达到220s超过海洋药物PSS，，衍生物E主要是通过影响内源性途径和共同凝血途径发挥抗凝作用，分子量在10-20KDa的抗凝活性最佳，具有较大的抗凝潜力。
【关键词】：褐藻胶 化学修饰 抗菌活性 抗凝活性 抗病毒活性
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-16
• 第一章 前言16-44
• 1. 褐藻胶的来源与结构16-21
• 1.1 褐藻胶的来源16-19
• 1.1.1 来源于褐藻植物细胞壁17
• 1.1.2 来源于微生物发酵17-19
• 1.2 褐藻胶的结构19-21
• 2. 褐藻胶及其衍生物的活性与应用21-25
• 2.1 抗肿瘤活性21-22
• 2.2 在心血管疾病方面的应用22
• 2.3 抗病毒活性22-23
• 2.4 促进生长活性23
• 2.5 在生物材料方面的应用23-24
• 2.6 褐藻胶在排除重金属方面应用24-25
• 2.7 在其它方面的应用25
• 3. 多糖的分子修饰25-30
• 3.1 降低分子量26-27
• 3.1.1 化学降解26-27
• 3.1.2 酶降解27
• 3.1.3 物理降解27
• 3.2 硫酸酯化27-28
• 3.3 脱硫酸基28
• 3.4 磷酸酯化修饰28-29
• 3.5 其他分子修饰的方法29-30
• 3.5.1 烷基化修饰29
• 3.5.2 乙酰化反应29-30
• 4. 褐藻胶的化学修饰30-36
• 4.1 羧基基团的化学修饰31-33
• 4.1.1 成酯反应31-32
• 4.1.2 Ugi 反应32
• 4.1.3 酰胺化反应32-33
• 4.2 羟基基团的化学修饰33-36
• 4.2.1 氧化33-34
• 4.2.2 还原氨化氧化的褐藻胶34-35
• 4.2.3 硫酸化35
• 4.2.4 环糊精联系褐藻胶35-36
• 4.3 褐藻胶化学修饰的前景36
• 5. 弧菌与弧菌病36-41
• 5.1 重要的水产养殖致病菌37-38
• 5.1.1 溶藻弧菌(V．alginolyticus)37
• 5.1.2 鳗弧菌(V.anguillarum)37-38
• 5.1.3 副溶血弧菌（V.Parahaemolyticus）38
• 5.2 弧菌病与海水养殖业的关系38-41
• 5.3 褐藻胶与水产养殖41
• 6. 本课题的立题背景及研究意义41-44
• 第二章 系列不同结构褐藻胶的制备及高 G 褐藻胶微球的制作44-61
• 引言44
• 1. 实验材料、试剂与仪器44-46
• 1.1 实验材料44-45
• 1.2 实验试剂45
• 1.3 实验仪器45-46
• 2. 实验方法46-51
• 2.1 褐藻胶的提取46-47
• 2.2 不同分子量褐藻胶制备47-48
• 2.3 分子量的测定48
• 2.4 多糖理化性质分析48-50
• 2.4.1 样品总糖含量测定48
• 2.4.2 样品糖醛酸含量测定48-49
• 2.4.3 粗蛋白含量的测定49
• 2.4.4 硫酸根含量的测定49-50
• 2.5 醋酸纤维素膜电泳分析50
• 2.6 红外光谱分析50
• 2.7 褐藻胶 M/G 分析50
• 2.8 高 G 褐藻胶包含酵母菌细胞的微球制作50-51
• 3 实验结果与讨论51-60
• 3.1 理化性质分析51-52
• 3.2 分子量分析及纯度测定52-54
• 3.3 红外光谱分析54-55
• 3.4 核磁共振波谱分析55-58
• 3.5 系列分子量褐藻胶制备58-59
• 3.6 微球的制作59-60
• 4. 本章小结60-61
• 第三章 具有抗病毒和抗菌活性的褐藻胶衍生物制备61-92
• 引言61-62
• 1. 实验材料、试剂与仪器62-63
• 1.1 实验材料62
• 1.2 实验试剂62-63
• 1.3 实验仪器63
• 2. 褐藻胶-PEG-N3衍生物的制备63-71
• 2.1 实验部分64-65
• 2.2 反应条件对反应的影响65-67
• 2.2.1 EDC 的量对反应得率的影响65-66
• 2.2.2 反应时间对得率的影响66
• 2.2.3 温度对反应的影响66-67
• 2.3 结构表征67
• 2.3.1 通过1H-NMR 对褐藻胶叠氮化修饰的定量67
• 2.3.2 红外光谱（IR）测定67
• 2.4 结果讨论67-71
• 2.4.1 红外光谱分析67-69
• 2.4.2 核磁共振1H-NMR 分析69-71
• 3. 褐藻胶三氮唑杂环衍生物的制备71-82
• 3.1 实验部分72-73
• 3.1.1 甲基丙炔与褐藻胶-PEG-N3b 反应（羧甲基三氮唑-PEG-褐藻胶 c）72-73
• 3.1.2 3-乙炔基噻吩和褐藻胶-PEG-N3b 反应（3-噻吩并三氮唑-PEG-褐藻胶d）73
• 3.2 反应条件对反应的影响73-76
• 3.2.1 反应时间对反应的影响73-74
• 3.2.2 反应温度对转化率的影响74-75
• 3.2.3 催化剂硫酸铜/抗坏血酸钠对反应的影响75
• 3.2.4 微波辅助对反应的影响75-76
• 3.3 结构表征76-77
• 3.3.1 红外光谱（IR）测定76-77
• 3.3.2 核磁共振波谱测定77
• 3.4 结果讨论77-82
• 3.4.1 红外光谱分析77-78
• 3.4.2 核磁共振波谱分析78-82
• 4. 衍生物的体外抗甲型流感病毒（H1N1）活性研究82-85
• 4.1 实验方法82
• 4.2 结果讨论82-85
• 5. 抗菌活性85-90
• 5.1 实验方法85
• 5.1.1 培养基的配置85
• 5.1.2 菌悬液的制备85
• 5.1.3 平板打孔测抑菌圈法85
• 5.2 结果与讨论85-90
• 6. 本章小结90-92
• 第四章 具有抗凝作用褐藻胶衍生物的制备及抗凝活性评价92-111
• 引言92-94
• 1. 实验材料、试剂与仪器94-95
• 1.1 实验材料94
• 1.2 实验试剂94
• 1.3 实验仪器94-95
• 2. 褐藻胶类肝素衍生物制备95-97
• 2.1 褐藻胶的还原95
• 2.2 氧化95
• 2.3 化合物 C 的还原胺化95-96
• 2.4 化合物 D 的硫酸化96-97
• 2.4.1 传统的三氧化硫-吡啶法96
• 2.4.2 非传统的中间体法96-97
• 3. 化合物 E 的抗凝活性研究97-99
• 3.1 血浆的准备98
• 3.2 APTT 测定98
• 3.3 PT 测定98-99
• 3.4 TT 测定99
• 4. 结果讨论99-109
• 4.1 褐藻胶的羧基还原99-100
• 4.2 还原褐藻胶 B 的溴水氧化100
• 4.3 氧化褐藻胶的还原氨化100-101
• 4.4 化合物 D 的硫酸化101-105
• 4.4.1 硫酸化试剂制备的优化101-102
• 4.4.2 硫酸酯化反应条件优化102-105
• 4.4.3 两种硫酸化工艺比较105
• 4.5 化合物 E 红外光谱分析105-106
• 4.7 抗凝活性分析106-109
• 5. 本章小结109-111
• 结语111-114
• 1. 主要结论111-113
• 2. 创新点113
• 3. 下一步研究计划113-114
• 参考文献114-125
• 个人简历125
• 学术成果125-126
• 参与的课题126-127
• 致谢127-128

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