缺第4外显子的IL-7剪接变异体蛋白的活性研究

发布时间：2017-04-04 22:03

  本文关键词：缺第4外显子的IL-7剪接变异体蛋白的活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：白细胞介素7(interleukin-7,IL-7)的全长基因全长包含6个外显子(531bp),当受某些因素影响导致其中的一个或几个外显子被跳过,便形成了许多长短不一的、来源相同基因的m RNA,从而产生新的不同IL-7剪接变异体蛋白。IL-7δ4是IL-7缺第4外显子的剪接变异体,其一级结构与IL-7有差异,其功能可能参与IL-7功能调节,甚至获得新功能或与IL-7功能相拮抗。正常人体内多个器官都能检测到IL-7δ4m RNA,但其生物功能尚未清楚。此外,在多个肿瘤细胞株、多发性硬化症病人中其m RNA水平异常增高,IL-7δ4是否参与了相关疾病的发生发展亦有待研究。目的:本文将利用原核表达载体p ET-21b表达IL-7δ4,经复性、纯化及Westren-blot鉴定,获得具有生物活性的IL-7δ4蛋白,并对其活性功能进行研究,这对其正常生理功能的探讨、相关疾病的及时诊治都具有十分重要意义。方法:1.rh IL-7δ4蛋白的制备:利用本室保存的18-T-IL-7δ4为模板进行亚克隆,构建rh IL-7δ4原核表达载体p ET-21b-IL-7δ4,对其进行诱导表达及可溶性分析,并优化表达条件。rh IL-7δ4蛋白以包涵体形式表达,采用梯度透析法进行复性,并经过亲和层析色谱法纯化。最后,分别以6×His小鼠单克隆抗体和鼠抗人IL-7抗体为一抗,对纯化后rh IL-7δ4蛋白进行Western Blot鉴定。2.rh IL-7δ4蛋白对正常人外周血单核细胞的作用:BCA法测定其浓度后,以rh IIL-7为阳性对照研究rh IIL-7δ4的活性,采用Western-bolt法检测其对外周血单核细胞凋亡蛋白BCL-2表达,以及应用流式细胞术分析其对人外周血单核细胞凋亡的影响。3.rh IL-7δ4蛋白对肺成纤维细胞MCR-5的影响:以TGF-β1、rh IL-7、rh IL-7δ4干预MCR-5细胞,MTT法检测其增殖率,以及Western-blot法检测collagen I、α-SMA蛋白表达。结果:1.rh IL-7δ4蛋白的原核表达、复性及纯化:成功构建了重组原核表达质粒p ET-21b-IL-7δ4。PCR可扩增出约399bp的目的片段,与预期的一致,且测序结果与Gen Bank中IL-7δ4基因序列比较,彼此完全吻合。通过稀释与梯度透析过程,rh IL-7δ4蛋白的复性效率可达65%,纯化后其纯度均达到了95%以上,且纯化样品经Western Blot证实为rh IL-7δ4。2.rh IL-7δ4蛋白对正常人PBMCs的作用:在体外,rh IL-7δ4能明显提高PBMC的BCL-2蛋白表达,抑制PBMCs的凋亡(P0.01),与rh IL-7作用是一致的。3.rh IL-7δ4蛋白对MCR-5细胞的作用:当TGF-β1、rh IL-7、rh IL-7δ4分别作用于体外培养的MRC-5细胞,都促进细胞增殖(P0.01),但作用强度有差异(TGF-β1rh IL-7δ4rh IL-7),且都能诱导细胞collagen I、α-SMA蛋白表达增加(P0.05)。当TGF-β1分别与rh IL-7及rh IL-7δ4合用时,上述的蛋白表达增加效应更明显,而预先用以IL-7R抗体处理MRC-5细胞,则能逆转rh IL-7及rh IL-7δ4的蛋白表达诱导效应。结论:本研究采用原核表达系统表达rh IL-7δ4蛋白,优化其表达条件,经过复性和纯化,成功获得高纯度的rh IL-7δ4蛋白。在体外,rh IL-7δ4能明显提高PBMC的BCL-2蛋白表达,抑制PBMCs的凋亡,这表明rh IL-7δ4也参与机体的免疫调节。此外,rh IL-7δ4能诱导MCR-5增殖,上调其collagen I、α-SMA蛋白表达,这提示rh IL-7δ4具有诱导纤维化的作用。
【关键词】：缺乏第4外显子的IL-7剪接变异体 原核表达 纯化 活性鉴定
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 第一章 序言12-16
• 1.1 研究背景12-15
• 1.1.1 白细胞介素7及其剪接变异体12-13
• 1.1.2 选择性剪接13-15
• 1.1.3 纤维化疾病15
• 1.2 研究思路15-16
• 第二章 剪接变异体蛋白rhIL-7δ4 的原核表达、纯化以及鉴定16-38
• 2.1 前言16
• 2.2 实验材料16-24
• 2.2.1 菌株16
• 2.2.2 主要试剂16-17
• 2.2.3 合成引物17
• 2.2.4 主要仪器设备17-18
• 2.2.5 主要溶液配制18-24
• 2.3 实验方法24-31
• 2.3.1 制备感受态DH5α 及BL2124
• 2.3.2 rhIL-7δ4 表达载体的构建24-26
• 2.3.3 rhIL-7δ4 蛋白诱导表达条件的优化、可溶性鉴定26-27
• 2.3.4 rhIL-7δ4 蛋白变性与复性27-28
• 2.3.5 rhIL-7δ4 蛋白的纯化28-30
• 2.3.6 rhIL-7δ4 蛋白Western-blot鉴定30-31
• 2.4 实验结果31-36
• 2.4.1 成功构建rhIL-7δ4 原核表达载体31-33
• 2.4.2 rhIL-7δ4 蛋白诱导表达条件优化、可溶性分析33-34
• 2.4.3 rhIL-7δ4 蛋白的复性及纯化34-35
• 2.4.4 Western-blot鉴定rhIL-7δ4 蛋白35-36
• 2.5 讨论36-38
• 第三章 rhIL-7δ4 蛋白对人外周血单核细胞PBMCs的作用38-50
• 3.1 前言38
• 3.2 实验材料38-41
• 3.2.1 人外周静脉血38
• 3.2.2 主要试剂38-39
• 3.2.3 主要仪器设备39
• 3.2.4 主要溶液配制39-41
• 3.3 实验方法41-44
• 3.3.1 rhIL-7δ4 蛋白的脱盐和保存41
• 3.3.2 rhIL-7δ4 蛋白含量测定41-42
• 3.3.3 rhIL-7δ4 蛋白对外周血单个核细胞（PBMCs） BCL-2 蛋白表达的影响42-44
• 3.3.4 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测44
• 3.3.5 统计学处理44
• 3.4 实验结果44-48
• 3.4.1 rhIL-7δ4 蛋白稳定性试验44-45
• 3.4.2 蛋白含量测定45-46
• 3.4.3 BCL-2 蛋白表达的检测46-47
• 3.4.4 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测47-48
• 3.5 讨论48-50
• 第四章 rhIL-7δ4 蛋白对肺成纤维细胞MRC-5 的作用50-63
• 4.1 前言50-51
• 4.2 实验材料51-53
• 4.2.1 细胞株51
• 4.2.2 主要试剂51
• 4.2.3 主要仪器设备51
• 4.2.4 主要溶液配制51-53
• 4.3 实验方法53-56
• 4.3.1 MRC-5 培养方法53-54
• 4.3.2 TGF-β1 对MRC-5 增殖及collagen I蛋白、α-SMA蛋白表达的影响54-55
• 4.3.3 rhIL-7δ4 蛋白对MRC-5 增殖及collagen I蛋白、α-SMA蛋白的影响55-56
• 4.3.4 抗IL-7R /CD127 抗体干预细胞MRC-5 后的影响56
• 4.4 实验结果56-61
• 4.4.1 MTT法检测细胞增殖率56-57
• 4.4.2 Western Blot检测collagen I蛋白、α-SMA蛋白的表达57-61
• 4.5 讨论61-63
• 全文总结63-64
• 研究展望64-65
• 参考文献65-73
• 攻读学位期间科研情况73-74
• 附录1英文缩写语中文对照74-76
• 致谢76-77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 彭羽瑜;陈鉴华;严思;李晓波;金小宝;朱家勇;潘德顺;;重组人白细胞介素7蛋白的表达、复性和纯化[J];免疫学杂志;2014年05期

2 冯凤兰;彭羽瑜;潘德顺;李晓波;金小宝;朱家勇;;白细胞介素7剪接变异体的克隆和序列分析[J];中国临床药理学与治疗学;2012年04期

3 张彩霞;刘学军;;磷酸化c-jun氨基末端激酶蛋白和α-平滑肌肌动蛋白在肺纤维化大鼠中的表达及意义[J];中国药物与临床;2012年01期

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本文编号：285968