七种立克次体甄别检测基因芯片的研制

发布时间：2017-04-05 10:14

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【摘要】：目的:立克次体(Rickettsiae)是一类除极少数外专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌,其引起的立克次体病是一类重要的急性发热性人畜共患疾病。目前世界范围内已发现具有致病性的立克次体有20余种,在我国,根据感染患者的病原体培养以及免疫学和分子诊断学检测结果显示,主要有10种立克次体病,包括:地方性斑疹伤寒、流行性斑疹伤寒、Q热、恙虫病、猫抓病、黑龙江蜱传斑点热、北亚蜱传斑点热、内蒙古蜱传斑点热以及新发立克次体病人粒细胞无形体病(HGE)和人单核细胞埃立克体病(HME)等。近些年来,斑点热新种的不断出现,埃立克体等新发立克次体的流行,都在提示立克次体病大规模流行和突然暴发的可能性。此外立克次体作为潜在的生物恐怖病原体,也日益受到重视,其中落基山斑点热、Q热以及流行性斑疹伤寒已被列为生物战剂。因此,加强立克次体的监测与防治具有重要的现实意义。本文旨在建立一种能同时检测七种立克次体的化学发光基因芯片方法,为立克次体病的临床诊断和流行病学调查提供一种新的高通量检测手段。方法:1、根据前期文献调研结果,确定本研究拟检测的病原体及其靶基因。2、收集病原体样本,无样本的病原体人工合成基因片段,采用重叠延伸PCR的方法构建其靶基因,然后制备质粒参考品。3、设计合成特异性引物和探针,并进行筛选。4、通过调节体系成分以及引物浓度配比优化多重PCR体系。5、制备阳性参考品和阴性参考品,评价芯片特异性;制备灵敏度参考品,评价灵敏度;芯片法与实时荧光PCR法同时检测梯度稀释的莫氏立克次体核酸,比较两种方法的灵敏度;制备模拟样本,评价芯片检测全血样本的准确性。结果:首先,根据文献调研确定检测的7种常见立克次体(莫氏立克次体、查菲埃立克体、普氏立克次体、斑点热群立克次体、柯克斯氏体、恙虫病东方体、嗜吞噬细胞无形体)。构建出7种立克次体的质粒参考品。对芯片的引物探针进行了筛选。共筛选出1对通用引物、4对特异性引物、8条特异性探针和1条立克次体属通用探针用来扩增和检测立克次体。对芯片的多重PCR体系进行了优化,重点优化了引物浓度配比和引物组合,确保全部靶基因均可以良好的扩增。根据优化结果,芯片共分为两组三重PCR体系;建立了立克次体化学发光基因芯片检测方法。最后,评价了芯片的关键性能指标。特异性评价结果显示,该芯片可以良好的甄别检测上述7种立克次体。该芯片检测质粒DNA的灵敏度为1.5×102-3×103copies/反应,检测模拟样本的灵敏度为103-104 copies/μl。模拟样本检测结果表明:检测符合率为100%。结论:成功建立了可同时甄别七种立克次体的化学发光基因芯片检测方法,特异性和灵敏度评价结果表明该芯片已达到预期的性能要求。可为立克次体病的临床诊断和流行病学调查提供一种新的高通量检测手段。
【关键词】：立克次体 基因芯片 多重PCR 化学发光 甄别检测
【学位授予单位】：河南中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R440;R96
【目录】：

• 中英文对照表4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-15
• 一材料与方法15-24
• 1 材料和仪器15-16
• 2 方法16-24
• 二结果24-35
• 1 病原体和靶基因的选择24
• 2 重叠延伸法构建含病原体靶基因序列质粒24-25
• 3 引物设计与筛选25-27
• 4 探针设计与筛选27-29
• 5 多重PCR的建立与优化29-30
• 6 芯片特异性评价30-32
• 7 芯片灵敏度评价32-33
• 8 模拟样本检测33-34
• 9 芯片判读标准的制定34-35
• 三讨论35-37
• 四结论37-38
• 致谢38-39
• 参考文献39-44
• 附录一：文献综述44-54
• 参考文献50-54
• 附录二：在校期间论文论著和科研情况54

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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2 林碧瑚,孙晓娟,李文广,林英姿,詹志农;应用L929细胞从患者血液中分离立克次体[J];海南医学院学报;2003年05期

3 高东旗,曹务春,赵秋敏,张习坦,方立群;我国北方蜱中人粒细胞埃立克体16SrRNA基因的检测[J];寄生虫与医学昆虫学报;2000年02期

4 崔红,陈霞萍,陈梅玲,郭兆彪,王津,翟俊辉,杨瑞馥;16SrDNA生物芯片微阵列方法检测立克次体的初步研究[J];军事医学科学院院刊;2003年03期

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6 吴光华;我国恙虫病流行病学研究现状与展望[J];中华传染病杂志;2000年02期

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本文编号：286931