GDF-15诱导iTregs分化及其机制研究

发布时间：2017-04-10 16:16

  本文关键词：GDF-15诱导iTregs分化及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:恶性肿瘤严重危害着人类的健康和生命,如何治疗恶性肿瘤是人类医学所面临的的重大难题。肿瘤免疫治疗成为继手术、放疗、化疗之后被逐渐认可的一种新兴治疗方法,然而肿瘤细胞躲避免疫细胞杀伤从而生长并进一步转移、侵袭即肿瘤免疫逃逸是肿瘤免疫治疗的最大障碍。具有抑制性功能的调节性T细胞(Treg)在肿瘤免疫逃逸中扮演着关键角色[1]。我们实验室前期通过噬菌体肽库筛技术筛选出可与免疫细胞表面结合的一系列肿瘤源性分子,其中TGF-β超家族成员GDF-15最为引起我们的关注。有研究显示GDF-15在血清中的含量与肿瘤的分期相关[2],且根据文献报道,在多种肿瘤患者的外周血和肿瘤浸润的T淋巴细胞中,Treg比例明显升高[3],我们课题组在前期实验中在结直肠癌患者体内,外周Tregs数量与血清中GDF-15的水平随肿瘤的恶性程度升高而增加,且首次发现肿瘤患者血清GDF-15水平与Treg比例两者呈现正相关,同时,文献报道GDF-15能够促Foxp3表达量上调[4],而Foxp3[5]作为Treg特异的分子标志,在Treg的发育与功能中起着至关重要的作用。因此我们推测,GDF-15在i Treg的诱导分化中可能具有重要作用。我们拟通过实时定量PCR、流式细胞术、ELISA等实验方法阐明GDF-15作用于na?ve CD4+T细胞使其向i Treg分化的诱导作用,探索GDF-15在诱导i Treg分化中的分子机制。方法:本课题计划从以下三方面进行研究:1、系统研究GDF-15诱导na?ve CD4+T细胞foxp3表达量升高。利用免疫磁珠法从人外周血中分离得到na?ve CD4+T细胞,加入GDF-15刺激,利用Real-time PCR及流式细胞术等实验方法证实GDF-15在m RNA水平上和蛋白水平上均能上调Foxp3,同时研究GDF-15对于上调foxp3有无时象特点;2、进一步确认GDF-15诱导后的na?ve CD4+T细胞能否向i Treg方向分化,即具有i Treg的表型和功能,我们通过实时定量PCR、ELISA和流式细胞术等实验方法分析了GDF-15刺激后的na?ve CD4+T细胞i Treg相关抑制性膜分子的表达水平,以及相关抑制性细胞因子的分泌水平。3、在进一步的GDF-15作用机制研究中,我们通过激光共聚焦、实时定量PCR、Western blot和双荧光素酶报告基因结合生物信息学分析,分析并阐明GDF-15诱导na?ve CD4+T细胞向i Tregs分化的分子机制。结果:通过以上实验我们得到了下列结果:1、GDF-15能够诱导na?ve CD4+T细胞foxp3表达量上调,在第一天就能观察到foxp3表达上调,在第三天出现显著变化。且在na?ve CD4+T细胞活化后两天内加入GDF-15刺激时,foxp3表达也可以上调,在活化两天以后再加入GDF-15刺激后,则无法上调foxp3表达。GDF-15刺激na?ve CD4+T细胞活化后不同时间点撤去GDF-15刺激,结果发现在撤去GDF-15刺激2天后,Foxp3上调比例均有所下降。2、加入GDF-15刺激后,na?ve CD4+T细胞在m RNA水平和蛋白水平上均高表达i Treg表面膜分子CD103、CD25、GITR等。同时,ELISA实验结果说明,抑制性细胞因子IL-10、TGF-β等在GDF-15刺激后也明显表达上调。以上实验结果显示,诱导后na?ve CD4+T细胞具有了i Treg样表型。3、根据文献提示[6],我们推测GDF-15可能通过结合TGF-βRII发挥作用。因此我们用TGF-βRII中和抗体对细胞表面的受体进行封闭,进而检测GDF-15是否依旧能够上调Foxp3。实时定量PCR结果显示,foxp3表达水平较未加受体抗体封闭组高,且激光共聚焦实验结果与Real-time PCR相符,提示我们GDF-15通过TGF-βRII发挥作用。我们利用了Smad通路抑制剂SB431542以及ERK通路抑制剂PD98059对Smad通路和ERK通路分别进行阻断,实时定量PCR结果表明,阻断Smad通路GDF-15刺激后foxp3表达量明显弱于GDF-15刺激组,而阻断ERK通路,GDF-15能够更加明显上调foxp3,Western blot结果也与实时定量PCR结果相一致。结果说明,GDF-15可以通过活化Smad通路进行信号传导,加入中和抗体封闭TGF-βRII后,Smad通路活化被抑制。对于ERK通路来说,GDF-15可以抑制ERK通路的活化,TGF-β受体封闭后GDF-15对ERK通路抑制状态也发生了部分逆转。双荧光素酶报告基因结果提示我们GDF-15上调Foxp3表达的转录因子可结合于Foxp3启动子的-1657bp至-1210bp处,结合生物信息学及实时定量PCR结果,我们推测GDF-15可能通过NFAT和CREB转录因子发挥作用。结论:GDF-15能够诱导na?ve CD4+T细胞Foxp3表达上调;促进其向i Treg方向分化,同时能够表达i Treg相关抑制性膜分子和分泌抑制性细胞因子;间接证实了GDF-15通过与TGF-βRII结合,激活Smad通路同时抑制ERK通路从而诱导i Treg分化。GDF-15可以诱导在肿瘤免疫逃逸中发挥负性调节的Treg的分化,提示GDF-15在肿瘤免疫逃逸中可能发挥重要作用,为未来打破肿瘤免疫逃逸状态从而治愈恶性肿瘤提供新思路与新方法。
【关键词】：GDF-15 调节性T细胞 肿瘤免疫逃逸
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-13
• 文献回顾13-25
• 实验一 系统研究GDF-15上调na?ve CD4~+T细胞Foxp3表达量25-35
• 引言25
• 1 实验材料25-27
• 2 实验方法27-31
• 3 实验结果31-34
• 4 讨论34-35
• 实验二GDF-15诱导na?ve CD4~+T细胞向i Treg分化35-46
• 引言35
• 1 实验材料35-36
• 2 实验方法36-40
• 3 实验结果40-44
• 4 讨论44-46
• 实验三GDF-15诱导na?ve CD4~+T细胞向i Treg分化机制研究46-60
• 引言46
• 1 实验材料46-48
• 2 实验方法48-51
• 3 实验结果51-58
• 4 讨论58-60
• 小结60-61
• 参考文献61-66
• 附录66-67
• 致谢67

【共引文献】

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本文编号：297105