精胺修饰糖脂共聚物介导基因治疗研究

发布时间：2017-04-11 05:24

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【摘要】：壳聚糖-硬脂酸嫁接物(Chitosan-g-stearic acid,CS-SA)具有较强的肿瘤细胞摄取和亚细胞器转运能力,可密接质粒DNA,实现基因有效转染和抗肿瘤基因治疗。研究表明,壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束可密接基因药物转运进入靶细胞,受较弱质子缓冲能力的限制,该嫁接物胶束存在内-溶酶体逃逸问题,影响转染效率。为增强基因载体的质子缓冲能力,促进基因给药系统的内-溶酶体逃逸,本研究选用精胺进一步修饰壳聚糖-硬脂酸,构建精胺-硬脂酸-壳聚糖/质粒DNA基因递送系统,考察精胺对基因转染效率和p53基因治疗的影响,并探讨其相关机理。选择酶法降解制备低分子量壳聚糖(Chitosan,CS)；碳二亚胺法合成壳聚糖-硬脂酸嫁接物(Chitosan-g-stearic acid,CS-SA)；高碘酸法合成精胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物(Spermine modified chitosan-g-stearic acid,SP-CS-SA)。核磁共振氢谱确证嫁接物化学结构。三硝基苯磺酸法测得CS-SA的氨基取代度为3.76%；元素分析法测得CS-SA六元糖环开环比例为12.42%,SP-CS-SA的精胺(SP)嫁接比例为7.59%。芘荧光法测得CS-SA、SP-CS-SA临界胶束浓度分别为116.3±16.3μg/mL、108.2±3.8μg/mL。微粒粒度与Zeta电位分析仪测得CS-SA、SP-CS-SA胶束(浓度均为0.2 mg/mL)的数均粒径分别为133.6±23.2 nm、128.4±19.8nm,表面电位分别为22.8±3.2mV、18.2±1.8 mV。透射电子显微镜观察,显示两种胶束的粒径分布均较窄,外观呈不规则类球形,其粒径略小于由微粒粒度与Zeta电位分析仪测定的结果。酸碱滴定法测得,SP修饰后CS-SA的离子缓冲能力有较大提高。CS-SA、Sp-CS-SA的EC-1、Bel-7402细胞毒性,均明显小于Lipofectamine TM2000和PEI 25K。共孵育法分别制备壳聚糖-硬脂酸/pDNA(CS-SA/pDNA)、精胺-壳聚糖-硬脂酸/pDNA (SP-CS-SA/pDNA)基因递送系统。CS-SA/pDNA、SP-CS-SA/pDNA均可有效密接pDNA,形成粒径均一的基因递送系统。基因递送系统具有良好的保护pDNA免受酶降解的能力。SP-CS-SA/pEGFP-C1的EC-1、Bel-7402细胞转染效率,分别为44.6±4.9%,33.5±2.3%,显著高于CS-SA/pEGFP-Cl (***P0.001),显示SP修饰显著提高了基因转染效率。细胞内共定位研究表明, 经SP修饰的SP-CS-SA/pDNA基因递送系统,可实现DNA从溶酶体的快速逃逸。研究结果显示,转染剂量条件下的CS-SA/pDNA、SP-CS-SA/pDNA,基本无细胞毒性。以Bel-7402为模型细胞,p53-EGFP-N1为治疗基因,考察CS-SA/P53-EGFP-N1、SP-CS-SA/p53-EGFP-N1基因递送系统的促肿瘤细胞凋亡作用。研究结果表明,SP-CS-SA/p53-EGFP-N1的Bel-7402细胞凋亡率为37.3±1.1%,明显大于CS-SA/p53-EGFP-N1 (10.1 ± 3.0%) (**P0.01),接近于PEI25K/p53-EGFP-N1,但低于LipofectamineTM2000/p53-EGFP-N1 (P0.05).选择SP修饰,可促进SP-CS-SA/p53-EGFP-N1基因表达,引起肿瘤细胞G1期阻滞,促进细胞凋亡。
【关键词】：精胺-壳聚糖 硬脂酸嫁接物 细胞摄取 内-溶酶体逃逸 基因转染 p53 细胞凋亡
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 第1章 精胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物的合成及其理化性质研究14-32
• 1.1 试剂与仪器14-15
• 1.1.1 试剂14-15
• 1.1.2 仪器15
• 1.2 实验方法15-19
• 1.2.1 低分子量壳聚糖的制备及分子量测定15-16
• 1.2.2 壳聚糖-硬脂酸嫁接物的合成16
• 1.2.3 精胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物的合成16-17
• 1.2.4 核磁共振分析17
• 1.2.5 氨基取代度测定17
• 1.2.6 元素分析17
• 1.2.7 临界胶束浓度测定17-18
• 1.2.8 粒径与表面电位测定18
• 1.2.9 透射电子显微镜观察18
• 1.2.10 离子缓冲能力考察18
• 1.2.11 细胞培养与细胞毒性18-19
• 1.2.11.1 细胞培养18-19
• 1.2.11.2 细胞毒性实验19
• 1.3 结果与讨论19-30
• 1.3.1 壳聚糖-硬脂酸嫁接物的合成及结构确证19-21
• 1.3.2 精胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物的合成及结构确证21-22
• 1.3.3 氨基取代度与精胺嫁接比例22-23
• 1.3.4 临界胶束浓度23-25
• 1.3.5 粒径与表面电位25-26
• 1.3.6 透射电子显微镜观察26-27
• 1.3.7 离子缓冲能力27-28
• 1.3.8 细胞毒性28-30
• 1.4 小结30-32
• 第2章 精胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物/pDNA复合物的制备及基因转染研究32-52
• 2.1 试剂与仪器32-33
• 2.1.1 试剂32-33
• 2.1.2 仪器33
• 2.2 实验方法33-37
• 2.2.1 嫁接物/pDNA复合物的制备33
• 2.2.2 粒径与表面电位测定33-34
• 2.2.3 透射电子显微镜观察34
• 2.2.4 凝胶阻滞分析34
• 2.2.5 酶保护实验34
• 2.2.6 体外基因转染34-35
• 2.2.6.1 胞培养34
• 2.2.6.2 基因转染及荧光观察34-35
• 2.2.6.3 基因转染流式定量研究35
• 2.2.7 胞摄取与细胞内定位35-37
• 2.2.7.1 嫁接物荧光标记35-36
• 2.2.7.2 细胞摄取与荧光观察36
• 2.2.7.3 胞内定位36-37
• 2.2.8 细胞毒性37
• 2.3 结果与讨论37-49
• 2.3.1 粒径与表面电位37-38
• 2.3.2 透射电子显微镜观察38-39
• 2.3.3 凝胶阻滞分析39-40
• 2.3.4 酶保护实验40-41
• 2.3.5 体外基因转染41-45
• 2.3.6 细胞摄取及细胞内定位45-49
• 2.3.7 胞毒性49
• 2.4 小结49-52
• 第3章 精胺-壳聚糖-硬脂酸嫁接物/p53的基因治疗研究52-60
• 3.1 试剂与仪器52-53
• 3.1.1 试剂52
• 3.1.2 仪器52-53
• 3.2 实验方法53-54
• 3.2.1 细胞培养53
• 3.2.2 p53-EGFP-N1体外基因转染53
• 3.2.3 细胞凋亡53
• 3.2.4 细胞周期53-54
• 3.3 结果与讨论54-57
• 3.3.1 p53-EGFP-N1体外基因转染54-55
• 3.3.2 细胞凋亡55-56
• 3.3.3 细胞周期56-57
• 3.4 小结57-60
• 结论60-62
• 参考文献62-68
• 综述68-82
• 参考文献78-82
• 作者简历82

【参考文献】

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1 叶轶青,胡富强,袁弘;壳寡糖嫁接硬脂酸阳离子聚合物胶团的制备及其理化性质[J];药学学报;2004年06期

  本文关键词：精胺修饰糖脂共聚物介导基因治疗研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：298428