合成达玛烯二醇酿酒酵母底盘细胞性能优化

发布时间：2017-04-11 09:09

  本文关键词：合成达玛烯二醇酿酒酵母底盘细胞性能优化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：植物萜类天然化合物在人们的生活中有着重要的作用,其中三萜化合物人参皂苷就具有很强的药用价值,具有抗炎、抗肿瘤活性。达玛烯二醇是一种人参皂苷的合成前体物,该前体物的积累有利于促进人参皂苷的生物合成。本文对达玛烯二醇合成酶(DS)蛋白活性进行了研究,并且将优化的外源基因DS导入酿酒酵母底盘中,调整优化了生产达玛烯二醇的代谢途径,提高了达玛烯二醇的产量。首先,根据TMHMM和TMPRED确定了DS序列中的跨膜区域,为得到游离DS蛋白以及研究跨膜区后PFTB重复序列对酶活性的影响,构建了表达截短DS的酵母菌株W303tDS0和W303tDS4。基于现已知的9个达玛烯醇合成酶蛋白序列比对,发现了29个氨基酸差异位点。为研究差异位点对DS活性的影响,本文对筛选的4个序列差异位点进行突变,构建了突变DS表达菌株W303DSΔa、W303DSΔ29、W303DSΔ252以及W303DSΔ624。截短和突变DS的菌株达玛烯二醇产量出现不同程度的降低,说明截短和突变的位点对DS活性有影响,可能是DS蛋白潜在活性位点。其次,基于I-TASSER和MODELLER对DS蛋白进行同源建模,并对蛋白模型去Clash优化得到最终的DS模型。模型显示DS蛋白包含两个α桶状结构区域,它们之间通过环状结构和3个较小的β结构连接在一起。蛋白活性位点的空腔结构处于两个大型结构域中间,即整个蛋白分子的中心区域。基于得到的DS蛋白三维结构,确定DS蛋白的活性催化位点为N端第488位的天冬氨酸Asp,它负责环化反应的第一步,给2,3-氧化鲨烯的环氧部分提供质子。Asp488由它三维空间结构临近的第489位和第568位的两个半胱氨酸Cys激活。Asp488,Cys489和Cys568这三个氨基酸在氧化鲨烯环化酶中展现出很强的保守性。此外,Trp421,Phe477,Trp538,Trp616,Tyr263,Tyr732起到稳定2,3-氧化鲨烯成环过程中底物折叠的作用。Cys264,Tyr268,Ile559是与底物进入催化活性位点的通道有关的活性位点。构建了达玛烯二醇合成酶基因DS的优化表达模块,与ERG1过表达模块一起整合到本实验室已有的酿酒酵母底盘W303TE的基因组rDNA位点上,得到产达玛烯二醇酵母工程菌WDS,达玛烯二醇产量为77.05 mg/L,且与W303TE相比达玛烯二醇前体物鲨烯的积累量减少了一半。在WDS基础上对MVA途径tHMGR、upc2.1、ERG1和ERG9过表达,通过多拷贝整合和强启动子表达强化了达玛烯二醇生产途径的前体供应,筛选得到达玛烯二醇酵母工程菌WDS-TU19。该菌株生长速率和发酵稳定期总菌体量优于W303TE和WDS,与底盘菌相比提前6小时到达稳定期,达玛烯二醇摇瓶发酵产量达到211.52 mg/L,与WDS相比提高到了2.7倍,同时解决了鲨烯在胞内的积累问题,胞内鲨烯含量仅为0.365 mgL。
【关键词】：达玛烯二醇 酿酒酵母 人参皂苷 同源建模
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914.5
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 文献综述10-25
• 1.1 萜类化合物的生物合成10-19
• 1.1.1 萜类化合物概述10-13
• 1.1.2 萜类合物分类及其生物合成的研究13-16
• 1.1.3 人参皂苷的生物合成16-19
• 1.2 酿酒酵母平台的合成生物学研究19-23
• 1.2.1 酿酒酵母作为底盘的平台优势与挑战19-20
• 1.2.2 酵母MVA途径相关基因的研究20-22
• 1.2.3 酿酒酵母平台中合成生物学应用22-23
• 1.3 本文研究内容及思路23-25
• 第二章 材料与方法25-35
• 2.1 实验菌株和质粒25-26
• 2.1.1 质粒25
• 2.1.2 菌株25-26
• 2.2 药品与试剂26-30
• 2.2.1 工具酶与药品26-28
• 2.2.2 实验试剂的配置28-29
• 2.2.3 培养基的配置29-30
• 2.3 实验仪器30
• 2.4 实验方法30-35
• 2.4.1 质粒构建30-32
• 2.4.2 酵母转化32-34
• 2.4.3 酵母发酵与产物提取34-35
• 第三章 达玛烯二醇合成模块的构建及DS活性的研究35-59
• 3.1 前言35-36
• 3.2 外源达玛烯二醇合成基因DS的优化36-37
• 3.3 外源优化DS模块的构建37-38
• 3.4 截短DS模块的构建38-42
• 3.4.1 DS跨膜结构域的分析38-40
• 3.4.2 截短tDS0和tDS4表达模块的构建40-42
• 3.5 不同来源DS蛋白序列的比对与定点突变42-46
• 3.5.1 现有DS序列比对与突变位点的选择42-43
• 3.5.2 DS模块的定点突变43-46
• 3.6 DS蛋白同源建模与活性位点预测46-55
• 3.6.1 DS蛋白模型的构建47-50
• 3.6.2 DS蛋白模型去Clash优化50-52
• 3.6.3 DS模型的评价与活性位点的预测52-55
• 3.7 不同DS达玛烯二醇产量的对比55-58
• 3.8 本章小结58-59
• 第四章 酿酒酵母生产达玛烯二醇途径的优化59-66
• 4.1 前言59
• 4.2 基因的提取59-61
• 4.3 MVA途径相关基因的模块构建61-63
• 4.4 酵母自组装构建底盘优化菌株63-65
• 4.5 本章小结65-66
• 第五章 产达玛烯二醇酵母工程菌的构建与发酵66-74
• 5.1 前言66
• 5.2 达玛烯二醇酿酒酵母工程菌的构建66-68
• 5.3 酵母工程菌生长曲线的测绘68-70
• 5.4 发酵产物的定性分析70-71
• 5.5 发酵产物的定量分析71-72
• 5.6 发酵结果与讨论72-74
• 第六章 结论与展望74-76
• 6.1 结论74-75
• 6.2 展望75-76
• 参考文献76-82
• 发表论文和参加科研情况说明82-83
• 致谢83-84

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