绣球菌发酵工艺优化及其多糖神经保护研究

发布时间：2017-04-11 23:11

  本文关键词：绣球菌发酵工艺优化及其多糖神经保护研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：绣球菌(Sparassis Crispa)是一种珍贵的药食两用真菌,具有提高免疫力、抗肿瘤、抗高血压、抗糖尿病等多种药理活性。绣球菌的有效成分主要有蛋白质、多糖、麦角固醇、葡糖苷酰鞘氨醇、腺苷和其他一些小分子化合物等。市场中的绣球菌产品非常少且昂贵,培养难度高,难以满足绣球菌的市场需求。在微生物工程方面,绣球菌发酵并不成熟,急需提高菌株的产量及有效成分的含量。同时在药理活性方面,绣球菌胞内多糖的活性也是人们关注的焦点。本文主要针对绣球菌在工业生产中存在的培养技术不成熟的问题及其药理活性进行了研究。采用亚硝基胍诱变的方法对绣球菌进行改良,以菌丝体干重为指标对突变株进行筛选,得到高产菌株SC031,干重是原始菌株的1.6倍。采用化学计量学的方法对该菌最佳的摇瓶培养基配方进行优化。最终确定绣球菌高产菌株SC031的最佳培养基配方:蔗糖30.67 g/L、酵母浸粉10.88 g/L、蛋白胨10 g/L,磷酸二氢钾2 g/L、硫酸镁1.59 g/L和维生素B1 0.10 g/L。对绣球菌高产菌株SC031的胞内多糖进行分离纯化获得SCWEA和SCWEB两个纯化胞内多糖组分。并采用HPLC色谱、动态光散射、紫外光谱、红外光谱及高碘酸氧化和Smith降解对其进行初步的结构分析。SCWEA和SCWEB的平均分子量和粒径大小分别为75和184 kDa,88.9 nm和1012.2 nm。SCWEA的单糖组成:鼠李糖、甘露糖和少量的半乳糖。SCWEB则由葡萄糖和极少量的阿拉伯糖组成。SCWEA和SCWEB组分中不存在核酸和蛋白质,含有·OH、C-H、C-O-C、C-O-H和强弱不同的C=O。在SCWEA中一定含有1→3糖苷键和1→6糖苷键,不存在1→4糖苷键,可能存在1→2糖苷键。其中1→3糖苷键在主链上而1→6糖苷键在侧链上。SCWEB主体很可能为为1,3β-葡聚糖。最后本文采用谷氨酸诱导的PC12细胞损伤模型来研究绣球菌高产菌株SC031的纯化多糖SCWEA和SCWEB的保护作用及其作用分子机制。采用MTT方法检测细胞凋亡的比例;Fluo-4-AM荧光染色法检测钙离子含量;JC-1荧光探针法分析细胞内线粒体膜电位的变化;DCFH-DA荧光染色法检测活性氧的积累;Western blot方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-x L、Akt、GSK等的表达。结果显示,SCWEA和SCWEB均可显著降低神经毒素所诱发的细胞凋亡率,可抑制神经毒素所致的细胞内钙离子浓度的增加,减少线粒体膜电位的降低,缓解神经毒素诱发PC12细胞胞内ROS的过量积聚,并调节细胞内抗凋亡蛋白的表达,可以通过线粒体的依赖途径及Akt/GSK通路修复谷氨酸诱导的PC12细胞损伤。为神经损伤类疾病的治疗提供了新思路,为新的抗神经退行性疾病制剂提供理论基础。
【关键词】：绣球菌 选育 发酵 胞内多糖 纯化 神经保护
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R915
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 第一章 绪论13-18
• 1.1 绣球菌概述13
• 1.1.1 绣球菌的生物活性成分13
• 1.1.2 绣球菌的药理学活性13
• 1.2 微生物发酵工程13-15
• 1.2.1 诱变选育13-14
• 1.2.2 微生物发酵优化方法14-15
• 1.3 神经退行性疾病15-17
• 1.3.1 神经元损伤模型16
• 1.3.2 细胞凋亡机制16-17
• 1.4 立题背景和研究意义17-18
• 第二章 绣球菌高产菌株的诱变选育与摇瓶培养基优化18-31
• 2.1 引言18
• 2.2 材料与仪器18-19
• 2.2.1 菌株18
• 2.2.2 仪器设备18-19
• 2.2.3 试剂19
• 2.2.4 培养基19
• 2.3 实验方法19-23
• 2.3.1 培养方法19
• 2.3.2 诱变选育与目的菌株的筛选19-20
• 2.3.3 有效成分提取及含量测定方法20
• 2.3.4 满意度函数的建立20-21
• 2.3.5 发酵培养基的优化21-23
• 2.4 结果与讨论23-29
• 2.4.1 诱变选育23
• 2.4.2 绣球菌高产菌株培养基优化23-29
• 2.5 本章小结29-31
• 第三章 绣球菌高产菌株SC031胞内多糖的分离纯化及初步结构分析31-40
• 3.1 引言31-32
• 3.2 材料与仪器32
• 3.2.1 菌株32
• 3.2.2 仪器设备32
• 3.2.3 试剂32
• 3.2.4 培养基32
• 3.3 实验方法32-34
• 3.3.1 SC031菌丝体的制备32-33
• 3.3.2 SC031胞内粗多糖的制备33
• 3.3.3 SC031胞内多糖的纯化33
• 3.3.4 SCWE粒径和分子量的测定33
• 3.3.5 SCWE的单糖组分分析33
• 3.3.6 SCWE紫外光谱检测33-34
• 3.3.7 SCWE红外光谱分析34
• 3.3.8 SCWE高碘酸氧化和Smith降解34
• 3.4 结果与讨论34-39
• 3.4.1 SC031胞内多糖的DEAE?52纤维素柱层析34-36
• 3.4.3 SC031胞内多糖的Sephadex G100柱层析36
• 3.4.4 SCWE分子量粒径及单糖组成分析36
• 3.4.5 SCWE紫外光谱检测36-37
• 3.4.6 SCWE的FTIR光谱分析37-38
• 3.4.7 SCWE的高碘酸氧化和Smith降解38-39
• 3.5 本章小结39-40
• 第四章 绣球菌纯化多糖神经保护活性及相关机制40-50
• 4.1 引言40
• 4.2 材料与仪器40-41
• 4.2.1 主要仪器40
• 4.2.2 试剂40-41
• 4.2.3 实验细胞41
• 4.3 实验方法41-43
• 4.3.1 PC12细胞的培养41
• 4.3.2 细胞活性测定41
• 4.3.3 细胞凋亡形态分析41-42
• 4.3.4 活性氧簇（ROS）活性测定42
• 4.3.5 细胞内钙离子浓度分析42
• 4.3.6 细胞线粒体膜通透测定42
• 4.3.7 Western blotting技术42-43
• 4.3.8 统计学方法43
• 4.4 实验结果与讨论43-48
• 4.4.1 SCWEA和SCWEB对L-谷氨酸诱导凋亡的PC12细胞存活率的影响43-44
• 4.4.2 SCWEA和SCWEB对L-谷氨酸诱导的PC12细胞内钙离子内流及ROS浓度的影响44-45
• 4.4.3 SCWEA和SCWEB对L-谷氨酸诱导的PC12细胞线粒体功能的影响45-47
• 4.4.4 SCWEA和SCWEB对L-谷氨酸诱导的PC12细胞损伤模型中Akt和GSK表达的影响47-48
• 4.5 本章小结48-50
• 第五章 全文研究成果与展望50-52
• 5.1 主要研究成果50-51
• 5.2 后续工作展望51-52
• 参考文献52-59
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果59-61
• 致谢61

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