肝素苄基酯制备及肝素废水蛋白回收研究

发布时间：2017-04-12 09:04

  本文关键词：肝素苄基酯制备及肝素废水蛋白回收研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肝素具有良好的抗凝血作用,目前被普遍用于手术治疗过程和抗静脉血栓形成等临床实践中,其临床应用价值是至今任何一种药物都无法替代的。其中伊诺肝素钠是目前研究最广、循证医学最多、使用最多的肝素类药品,占据肝素药物市场份额的50%以上。依诺肝素钠生产工艺中最关键的是肝素苄基酯制备,其酯化程度的不同,决定了分子量的大小,得率和效益。同时,在肝素生产中,传统抗凝血特性的效价测定主要依赖肉眼判断,试验误差大;采用国外试剂则价格昂贵。一种便于操作,成本较低且客观,准确,重现性好的效价测定方法,对提升中小企业肝素品质控制、降低生产成本、提高生产效益具有重要意义。此外,我国肝素加工废水约6000t/d,肝素在动物体内多以糖蛋白复合物的形式存在,生产中要用酶将肝素和蛋白分离,所以废水为富含氨基酸的高盐度有机物,COD值高,味道难闻,对环境污染大。但如果能回收废水中蛋白和有机物,不仅能减轻或清除环境污染,且能变废为宝,具有较好的生态和经济效益。针对以上情况,本论文主要研究了肝素苄基酯超声波辅助制备的优化;单通道凝血仪和兔全血法测定肝素钠效价;肝素钠废水蛋白沉淀回收。1、在肝素苄基酯的制备中:首先利用甲醇纯化原料,利用紫外分光度计和高效液相色谱进行了蛋白质、核酸和多硫酸软骨素的检测;然后通过单因素实验,确定了超声波功率、时间对酯化率的影响。最后在此基础上利用design expert软件优化设计实验,得到最佳工艺参数为:温度控制在35-40度,功率为400W,超声反应时间5.5h,处理酯化率优于对照样(反应25小时)的酯化率(4.65%),为5.35%,经纯化蛋白核酸含量明显降低,原料不含多硫酸软骨素。2、利用羊血浆活化凝血活酶时间来测定肝素钠效价的同时引入单通道凝血仪,实现微量、自动化操作。同时与中国药典的兔全血法作对比。均采用中国药典生物效价(3.3)法进行统计计算,经可行性检测证明测定的样品效价PT准确可行,两种方法的可行限率均符合药典要求。单通道凝血仪APTT法测得效价为90.65 IU/mg,兔血法测得效价为92.96 IU/mg。3、肝素钠废水蛋白沉淀回收的试验中:先初筛蛋白絮凝剂,再通过单因素试验,确定了絮凝剂FeCl3、膨润土、硅藻土的添加量,pH值对蛋白沉淀量的影响,在此基础上,采用Box-Benhnken Design(Design expert.v8.0.6.1)设计响应面试验,得到的较佳工艺参数为:pH7.5、沉淀剂FeCl30.38%、膨润土1.9%、硅藻土4.25%时,肠衣肝素废水蛋白沉淀率达51.13%,废水溶液变清澈,COD去除率达80.94%。
【关键词】：依诺肝素苄基酯 效价测定 纯化 酯化 超声波 蛋白质絮凝
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 1 文献综述9-20
• 1.1 肝素钠的结构及理化特性10-12
• 1.1.1 肝素钠的结构10-11
• 1.1.2 肝素钠的理化特性11-12
• 1.2 低分子肝素钠的结构及理化特性12-14
• 1.2.1 低分子肝素钠的结构12-13
• 1.2.2 低分子肝素钠的理化特性13-14
• 1.3 肝素钠和低分子肝素钠临床应用比较14-15
• 1.4 肝素钠生产的研究进展15-16
• 1.4.1 盐析法提取15
• 1.4.2 酶解提取法15-16
• 1.4.3 超声波提取16
• 1.5 低分子肝素钠生产的研究进展16-17
• 1.6 肝素钠效价测定的研究进展17-18
• 1.7 肝素钠污水处理的研究进展18-20
• 2 引言20-22
• 2.1 研究目的及意义20-21
• 2.1.1 肝素钠效价测定的目的和意义20
• 2.1.2 超声波法优化伊诺肝素钠酯化工艺研究的目的和意义20-21
• 2.1.3 肝素生产废水处理和蛋白回收的目的和意义21
• 2.2 研究内容21-22
• 3 实验材料及方法22-31
• 3.1 实验材料22
• 3.2 试剂及仪器22-23
• 3.3 方法23-31
• 3.3.1 肝素钠效价测定23-24
• 3.3.1.1 半自动凝血仪羊血浆法测定肝素钠效价23-24
• 3.3.1.2 兔血法测定肝素钠效价24
• 3.3.2 低分子伊诺肝素钠苄基酯的超声波制备24-25
• 3.3.2.1 粗品肝素钠的纯化24
• 3.3.2.2 肝素季铵盐的制备24
• 3.3.2.3 肝素苄基酯超声辅助制备程序24-25
• 3.3.3 肝素钠生产废水蛋白沉淀回收研究25-27
• 3.3.3.1 不同蛋白絮凝沉淀剂试验26
• 3.3.3.2 蛋白絮凝沉淀单因素实验26
• 3.3.3.3 响应曲面优化试验26-27
• 3.3.4 实验测定指标与检测方法27-30
• 3.3.4.1 紫外分光光度计测定蛋白和核酸的紫外吸收值27-28
• 3.3.4.2 多硫酸软骨素的测定28
• 3.3.4.3 酯化率的检测28-29
• 3.3.4.4 废水沉淀物中蛋白质含量的测定29
• 3.3.4.5 COD值的测定29-30
• 3.3.5 数据处理30-31
• 4 结果与分析31-46
• 4.1 效价测定31-33
• 4.1.1 APTT血凝仪效价测定31-33
• 4.1.2 兔血法和APTT测定测结果比较33
• 4.2 肝素钠粗品纯化后的杂质分析33-36
• 4.2.1 纯化后的得率33
• 4.2.2 肝素钠紫外吸收值对比33-35
• 4.2.3 多硫酸软骨素的检测35-36
• 4.3 苯甲醇标准曲线的绘制36-37
• 4.4 超声波辅助酯化的实验结果37-40
• 4.4.1 超声功率对肝素苄基酯的影响37
• 4.4.2 时间对酯化率的影响37-38
• 4.4.3 响应面优化实验38-40
• 4.4.3.1 模型的建立及其显著性分析38-39
• 4.4.3.2 响应面及等高线分析39
• 4.4.3.3 反应条件的优化及模型验证39-40
• 4.5 肝素钠生产废水蛋白沉淀回收研究40-46
• 4.5.0 原料液测定值40
• 4.5.1 不同蛋白絮凝沉淀剂试验40-41
• 4.5.2 蛋白絮凝沉淀单因素实验41-42
• 4.5.2.1 不同三氯化铁的添加量对蛋白沉淀的影响41
• 4.5.2.2 不同膨润土的添加量对蛋白沉淀的影响41
• 4.5.2.3 不同硅藻土的添加量对蛋白沉淀的影响41-42
• 4.5.2.4 溶液不同p H值对蛋白沉淀的影响42
• 4.5.3 蛋白絮凝沉淀响应曲面设计试验结果42-46
• 4.5.3.1 模型建立及显著性分析43-44
• 4.5.3.2 蛋白絮凝沉淀处理样COD去除率44-45
• 4.5.3.3 最优值预测与验证45-46
• 5 讨论46-49
• 5.1 肝素钠效价测定的影响46
• 5.2 肝素苄基酯制备的影响因素46-47
• 5.3 肝素废水蛋白沉淀回收讨论47-49
• 6 结论49-50
• 参考文献50-55
• 致谢55-56
• 作者简介56

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