2-吡咯烷酮衍生物HL-5201促人HepG-2细胞增殖和抗凋亡作用的研究

发布时间：2017-04-12 07:24

  本文关键词：2-吡咯烷酮衍生物HL-5201促人HepG-2细胞增殖和抗凋亡作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景和目的：我们的前期实验发现2-吡咯烷酮衍生物HL-5201[N-(2-吡啶基)-4-环己氨基-5-氧代-2,5-二氢-3-吡咯甲酸乙酯],体外对多种细胞具有明显的促增殖或促代谢活力作用,体内能够促进S180荷瘤小鼠肿瘤的生长,对原核表达系统制备的Caspase-3酶具有抑制活性。本论文拟通过研究2-吡咯烷酮衍生物HL-5201对人HepG-2增殖及凋亡的影响探讨该类化合物的促细胞增殖作用机制。其最终目的是阐明该类化合物的作用靶点,利用该靶点可开发抗肿瘤药物,或开发治疗代谢缓慢等相关疾病的药物,并为该类药物的安全使用提供理论和实验依据。实验方法：本研究采用MTT法检测了HL-5201体外对多种细胞株的促增殖作用,包括人HepG-2、人Hela、人EC 109、人MDA-MB-231、人HGC-27、人PC-3、小鼠RAW 264.7、小鼠脾细胞、小鼠BV-2、小鼠C 17.2及大鼠PC-12细胞株；观察HL-5201对幼龄小鼠体重的影响,研究HL-5201是否影响生长发育；MTT比色法探讨不同时间和不同浓度HL-5201对人HepG-2增殖及凋亡的影响；倒置显微镜观察药物作用后人HepG-2细胞形态学的改变；DAPI染色后荧光显微镜观察药物作用后人HepG-2细胞核形态学的变化。利用PI染色流式细胞仪观察药物作用后人HepG-2细胞周期分布的变化；应用JC-1染色法检测药物作用后细胞线粒体膜电位的变化。使用Western blotting免疫印迹分析方法和Caspase-3,-9酶活性检测试剂盒方法检测药物作用后细胞增殖和凋亡通路相关蛋白表达及酶活性表达的变化；借助通道抑制剂初步探讨HL-5201作用环节；通过MTT比色法检测HL-5201结构类似物对人HepG-2增殖和凋亡活性的影响。实验结果：1)HL-5201对人HepG-2、人Hela、人EC109有明显的促增殖作用,但不同细胞作用强度不同；对人HGC-27、人PC-3.小鼠C 17.2及大鼠PC-12表现为抑制增殖的作用,且其抑制作用具有浓度依赖性,HL-5201的浓度越大,抑制增殖的活性越强；而对于人MDA-MB-231、小鼠脾细胞、小鼠RAW 264.7、小鼠BV-2则表现为双向作用,在浓度较高时,表现为抑制增殖作用,低浓度时则表现为促进增殖的活性。2)HL-5201对幼龄小鼠各阶段体质量增重影响的结果显示,HL-5201仅在第1-5 d,以50 mg/kg剂量灌胃给药时能提高小鼠的平均日增重,增重率为7.8%,与空白对照组比较有显著性差异(P=0.016),其余剂量与时间段对小鼠的平均日增重均无影响(P0.05)。3)HL-5201对人HepG-2细胞株具有明显的促进增殖作用及拮抗MMC的细胞毒作用,且促增殖和拮抗作用的最适作用浓度为45μmol/L,最适作用时间为72 h。4)倒置显微镜下我们观察到空白对照组以及HL-5201组的细胞生长状况良好,细胞伸展呈梭型及多角形,细胞透亮,生长旺盛。经细胞计数后,HL-5201组的细胞数量要比空白对照组多,说明HL-5201具有促进细胞增殖的作用。而人HepG-2经丝裂霉素C (MMC)作用之后,倒置显微镜下可观察到细胞变圆,贴壁不牢固,有大量漂浮细胞,生长受到明显的抑制等现象。MMC+HL-5201组在倒置显微镜下可见细胞生长状况明显改善。经过细胞计数后,MMC+HL-5201组细胞的总数明显比MMC模型组多,而凋亡细胞数量比MMC组少。说明HL-5201能够抑制MMC对人HepG-2诱导凋亡的作用。5)经DAPI染色后,在荧光显微镜下可观察到空白对照组和HL-5201组的细胞核形态呈圆形,边缘清晰,染色均匀呈淡蓝色,细胞成片生长。HL-5201组的完整细胞核的数量明显多于空白对照组。MMC模型组经DAPI染色后,从荧光强度以及核形态可以鉴别出细胞发生凋亡的典型特征——细胞核固缩,染色质致密呈斑块状浓集于核膜下,可见明显的凋亡小体。MMC和HL-5201共同作用于人HepG-2,在荧光显微镜下虽然也能观察到很多凋亡小体,但MMC+HL-5201组完整细胞核的数量明显多于MMC凋亡组,而凋亡小体则明显少于MMC凋亡组。由此说明HL-5201能够通过促进细胞增殖以及抑制细胞凋亡的途径以达到增加细胞数量,延长生存时间的目的。6)我们通过PI染色流式细胞仪观察,发现HL-5201作用于人HepG-2细胞株后,其对细胞周期分布的影响不明显,只观察到与MMC模型组比较,MMC+HL-5201组的亚二倍体细胞数(凋亡细胞)下降4.7%,有统计学意义(P=0.045),其余相同细胞周期的细胞百分率两两比较,均没有统计学意义(P0.05)。7)从JC-1染色结果中我们可以观察到MMC组的HepG-2细胞经MMC作用之后线粒体膜电位下降,并且与空白对照组相比有显著性差异(P=0.000)。而经HL-5201作用后,我们可发现HL-5201除了能稳定正常的线粒体膜电位之外,还能稳定被MMC损伤的线粒体膜电位,提示其可抑制线粒体凋亡途径的开启,从而关闭后续的凋亡反应。8) Western blotting实验结果表明,与空白对照组相比,HL-5201组的Phospho-Akt(Ser 473)、Phospho-Bcl-2(Ser 70)、Phospho-Bad(Ser 112)蛋白的含量明显增加,Bad、Bax的表达则明显减少,对Akt、Bcl-2以及线粒体内部的Cytochrome C蛋白表达无明显影响。而当HL-5201与MMC合用后,与MMC模型组相比,HL-5201亦能明显上调Phospho-Akt(Ser 473)、 Phospho-Bcl-2(Ser 70)、Phospho-Bad(Ser 112)的水平,下调Bad、Bax的表达,以及将Cytochrome C蛋白稳定在线粒体内部。因此可以认为HL-5201通过调节上述蛋白基因的表达以及磷酸化,从而促进细胞的增殖分裂并拮抗MMC对人HepG-2细胞诱导的凋亡作用。9) Caspase-3和Caspase-9活性检测结果显示,MMC明显提高两者的活性,HL-5201作用于MMC诱导的HepG-2凋亡模型后,Caspase-9的活性由9.55U下调为7.12 U,有显著性差异(P=0.000),Caspase-3的的活性由8.64 U,下调为6.59 U,有显著性差异(P=0.009)。提示HL-5201可能通过抑制Caspase-3酶原及Caspase-9酶原的活化,进而抑制MMC诱导人HepG-2细胞的凋亡。10)MTT比色法检测信号通路阻断剂、蛋白酶或基因转录抑制剂对HL-5201作用于人HepG-2代谢活力变化的结果显示,与空白对照组相比,HL-5201对人HepG-2细胞的代谢活力或增殖具有明显的促进作用(P=0.000)。酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein、PI3K抑制剂LY 294002和Wortmannin、PKA抑制剂H 89. MAPKK抑制剂PD 98059和U 0126、p38 MAPK抑制剂SB203580、JAK-2抑制剂AG 490、JNK抑制剂SP 600125、蛋白酶体抑制剂MG 132、基因转录抑制剂Actinomycin D均能明显抑制HL-5201促进HepG-2细胞代谢活力,与HL-5201组比较均有显著性差异(P值均等于0.000)；而NF-κB抑制剂BAY 11-7082对HL-5201促进HepG-2细胞代谢活力无影响(P=0.220)。11)MTT比色检测HL-5201(5s)结构类似物对HepG-2增殖代谢活力及拮抗MMC细胞毒作用实验结果显示HL-5201(5s)、5b、5m、5n四个化合物对人HepG-2具有促增殖作用,但作用强度有差异。其中,4个化合物中5b在浓度为90μmol/L时对HepG-2促增殖效果最好,增殖率为44.91%。5n在浓度为60μmol/L对HepG-2促增殖作用具有统计学意义,但增殖效应仅为3.36%。5s、5b、5m对MMC所致人HepG-2的细胞毒性作用具有不同程度的拮抗作用。其中45 p.mol/L的HL-5201(5s)对MMC的拮抗作用最好,达19.81%；5b仅浓度为90μmol/L具有拮抗MMC的作用,当5b浓度下降到60μmol/L或以下,不仅拮抗效应消失,同时还能与MMC产生协同作用,促进HepG-2死亡。5n不具有拮抗MMC的作用。结论：1)HL-5201体外对不同的细胞表现的作用效果不同,有些表现为促进增殖,有些表现为抑制增殖,还有一些呈现双向作用,高浓度抑制,低浓度促进。2)HL-5201体外促细胞增殖作用具有选择性,不同细胞对HL-5201的敏感性不同。3)HL-5201对幼龄小鼠早期的生长有促进作用,但不会影响最终的发育与成熟。4)HL-5201能够促进人HepG-2细胞的增殖,同时能抑制MMC诱导人HepG-2细胞凋亡的作用。5)HL-5201(5s)的结构类似物体外对人HepG-2也具有促增殖和抑凋亡的活性,其活性受取代基的影响。6)综合分析所有的实验结果提示HL-5201的作用靶点在PI3K/ Akt信号通路中Akt的上游。其作用机制可能是：通过激活酪氨酸激酶、PBK/ Akt和MAPK等信号通路,激活蛋白酶体,促进有关蛋白磷酸化,从而增强细胞的代谢能力和增殖能力,同时还能够通过阻碍线粒体凋亡途径的开启,解除MMC对细胞G2期的阻滞而抑制凋亡。
【关键词】：2-吡咯烷酮类衍生物 HL-5201 细胞增殖 抗凋亡 作用机制
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 第一章 前言16-24
• 参考文献21-24
• 第二章 2-吡咯烷酮衍生物HL-5201对细胞代谢活力/增殖及小鼠体重的影响24-32
• 1 实验材料24-26
• 2 实验方法26-27
• 3 统计分析27
• 4 实验结果27-29
• 5 讨论29-31
• 6 结论31
• 7 参考文献31-32
• 第三章 2-吡咯烷酮衍生物HL-5201对人HepG-2细胞促增殖及抗凋亡作用32-72
• 1 实验材料32-36
• 2 实验方法36-45
• 3 统计分析45
• 4 实验结果45-57
• 5 讨论57-66
• 6 结论66
• 7 参考文献66-72
• 第四章 2-吡咯烷酮衍生物HL-5201(5s)、5b、5m、5n对人HepG-2增殖的影响72-81
• 1 实验材料72-75
• 2 实验方法75
• 3 统计分析75-76
• 4 实验结果76-78
• 5 讨论78-80
• 6 结论80
• 7 参考文献80-81
• 附录81-84
• 攻读学位期间成果84-85
• 致谢85-86

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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本文编号：301019