基于心脏组织的转录组学分析AEE治疗大鼠血栓的调控机制

发布时间：2017-04-13 21:24

  本文关键词：基于心脏组织的转录组学分析AEE治疗大鼠血栓的调控机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：AEE是由阿司匹林和丁香酚两种分子前体合成的一种新酯化物。研究表明AEE在抗血栓和抗炎方面比阿司匹林副作用小、毒性低,在治疗和预防各种血栓性疾病中发挥着非常显著的作用,但尚未对AEE抗血栓的作用机制及其靶基因进行研究。本研究利用腹腔注射角叉菜胶建立wistar大鼠血栓模型,将实验大鼠分为6组,每组7只,包括10、15、20、25mg/kg和30mg/kg角叉菜胶剂量诱导血栓组,对照组注射2m L生理盐水。在6、12、18h和24h测量血栓黑尾长度,统计学分析剂量和时间对血栓黑尾长度和血栓黑尾比率的影响,通过病理学观察和血细胞形态观察确立贴近临床研究和病理学研究的血栓模型;利用AEE、阿司匹林、丁香酚、羧甲基纤维素钠、阿司匹林和丁香酚药物对血栓模型大鼠口服给药7天,解剖大鼠获得心脏组织,提取组织总RNA进行基因表达谱芯片分析,统计不同药物对心脏组织的差异表达基因,并且做不同药物与血栓模型组、正常组和药物溶剂组对比的维恩图分析。对基因表达谱芯片结果做聚类分析和信号通路分析,筛选在心脏组织中药物共同参与的信号通路,同时确定该信号通路中重要的差异表达基因,并且结合qRT-PCR对不同药物处理组、正常组和模型组的差异表达基因进行分析和验证。研究获得的主要结果如下:1.基于病理学和血细胞观察进行药物诱导血栓模型建立的剂量和时间研究,发现在环境温度18±2℃时用角叉菜胶腹腔注射诱导血栓形成,6 h时血栓诱导率达100%。统计分析表明,相同剂量下,时间对血栓黑尾长度的影响不显著(P0.05),而在相同时间情况下剂量对其影响显著(P0.05);20 mg/kg角叉菜胶剂量较其它剂量在尾长度和黑尾比率方面均显著(P0.05),24 h时血栓黑尾比率为78.45%,该剂量下大鼠肠系膜无病变产生,腹腔内无积水,同时血细胞发生明显凝集并形成血栓。结果表明,20 mg/kg角叉菜胶腹腔注射可以建立安全的、贴近临床研究的血栓模型,为血栓类疾病和新药研究可提供合格的动物病理模型。2.统计基因表达谱芯片各药物处理组的差异基因数目和对差异基因做多重对比的维恩图分析,发现中剂量AEE及阿司匹林和丁香酚联合用药组与模型组比较差异表达基因数目分别为7076和9988,同时与正常组比较差异表达基因数目分别为7593和8728,是所有药物组中差异基因数目最多的;AEE差异表达基因数目高于阿司匹林和丁香酚。维恩图对不同药物处理组进行对比分析发现,中剂量AEE及阿司匹林和丁香酚联合用药组与模型组比较共同差异表达基因数目为4610,与正常组比较共同差异表达基因数目为4266,在所有药物处理组中差异基因数目最多;所有AEE剂量组共同差异表达基因数目高于阿司匹林和丁香酚。3.对AEE与其它药物处理组基因表达谱数据进行多重聚类和KEGG Pathway分析筛选信号通路和靶基因,并用qRT-PCR进行验证分析。通过聚类分析发现AEE主要影响蛋白质、脂类、炎症介质和离子反应相关的生物学过程、细胞组分和分子功能发挥抗血栓作用;KEGG Pathway分析发现AEE主要通过影响补体和凝血级联信号通路发挥其抗血栓作用。对补体和凝血级联信号通路分析筛选出5个靶基因,分别是Fga、Fgb、F2、Serpinc1和Plaur基因;qRT-PCR分析5个靶基因,发现AEE在抗血栓过程中Fga、Fgb、F2和Serpinc1基因下调,Plaur基因上调与芯片结果基本一致。结果表明AEE不仅具有与前体药物一样的抗血小板作用,同时还特异性的发挥其溶栓作用。对血栓形成后引起的细胞癌变与肿瘤有治疗作用,在抗血栓治疗中达到标本兼治的效果。
【关键词】：血栓模型 AEE 基因表达谱芯片 差异表达基因 信号通路 qRT-PCR
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R965
【目录】：

• 摘要2-4
• Summary4-7
• 缩略语表7-13
• 第一章 文献综述13-27
• 1.1 凝血和抗凝血机制概述13-19
• 1.1.1 血栓形成研究13-16
• 1.1.1.2 凝集系统13-14
• 1.1.1.3 血小板激活和聚集14-15
• 1.1.1.4 血液流动条件的改变15-16
• 1.1.2 抗凝血研究16-19
• 1.1.2.1 抑制组织因子16
• 1.1.2.2 抑制凝血途径16
• 1.1.2.3 抗血小板聚集16
• 1.1.2.4 抑制血小板膜受体16-17
• 1.1.2.5 核苷酸系统上的影响17
• 1.1.2.6 抑制血小板颗粒分泌17-18
• 1.1.2.7 影响花生四烯酸系统18
• 1.1.2.8 纤维蛋白溶解18-19
• 1.2 AEE研究概述19-21
• 1.2.1 AEE的药理学作用19-21
• 1.2.1.1 抗炎作用19-20
• 1.2.1.2 抗血小板凝集作用20
• 1.2.1.3 镇痛作用20
• 1.3.1.4 解热作用20
• 1.3.1.5 抗氧化作用20-21
• 1.2.2 毒性研究21
• 1.3 基因芯片研究概述21-24
• 1.3.1 基因芯片的应用22-23
• 1.3.1.1 药物筛选和新药开发22
• 1.3.1.2 疾病诊断22
• 1.3.1.3 环境保护22-23
• 1.3.2 基因芯片的研究领域23-24
• 1.3.2.1 基因表达检测23
• 1.3.2.2 寻找新基因23
• 1.3.2.3 DNA测序23-24
• 1.3.2.4 核酸突变的检测及SNP分析24
• 1.4 研究的目的和意义24-25
• 1.5 技术路线25-27
• 1.5.1 血栓模型25-26
• 1.5.2 信号通路和靶基因分析26-27
• 第二章 wistar大鼠血栓模型的建立和研究27-34
• 2.1 实验材料27-28
• 2.1.1 实验动物27
• 2.1.2 试剂和仪器27-28
• 2.2 实验方法28-29
• 2.2.1 药物剂量28
• 2.2.2 腹腔注射28
• 2.2.3 病理学观察28
• 2.2.4 细胞形态观察28-29
• 2.2.5 统计分析29
• 2.3 实验结果29-32
• 2.3.1 血栓29
• 2.3.2 血栓黑尾长度分析29-30
• 2.3.3 血栓黑尾比率分析30-31
• 2.3.4 病理学分析31-32
• 2.3.5 血细胞形态观察32
• 2.4 讨论32-34
• 第三章 心脏组织基因表达谱分析34-48
• 3.1 实验材料34
• 3.1.1 实验动物34
• 3.1.2 组织样品34
• 3.2 实验试剂与仪器34
• 3.3 实验方法34-39
• 3.3.1 血栓模型34
• 3.3.2 药物剂量和分组34-35
• 3.3.3 制备基因表达谱芯片35-38
• 3.3.3.1 Total RNA提取35-36
• 3.3.3.2 Total RNA的纯化36
• 3.3.3.3 RNA浓度测定36
• 3.3.3.4 cDNA合成36-37
• 3.3.3.5 cDNA荧光标记37
• 3.3.3.6 cDNA样品片段化37-38
• 3.3.3.7 芯片杂交和洗涤38
• 3.3.3.8 芯片扫描38
• 3.3.4 芯片生物信息学分析38-39
• 3.3.4.1 差异基因筛选和分析38
• 3.3.4.2 维恩图分析38-39
• 3.4 实验结果39-46
• 3.4.1 血栓形成39
• 3.4.2 RNA质量检测结果39-40
• 3.4.3 心脏组织基因表达谱芯片检测结果40-43
• 3.4.3.1 治疗组与正常组基因表达谱结果分析40-41
• 3.4.3.2 治疗组与模型组基因表达谱结果分析41-42
• 3.4.3.3 治疗组与CMC-Na药物溶剂组基因表达谱结果分析42
• 3.4.3.4 CMC-Na药物溶剂基因表达图结果分析42-43
• 3.4.3.5 模型组和正常组基因表达谱结果分析43
• 3.4.4 药物抗血栓作用的相关性分析43-46
• 3.4.4.1AEE对血栓基因表达的影响43
• 3.4.4.2 AEE、阿司匹林和丁香酚对血栓基因表达的影响43-44
• 3.4.4.3 AEE、阿司匹林和丁香酚与联合用药对血栓基因表达的影响44-46
• 3.5 讨论46-48
• 第四章 AEE抗血栓作用信号通路和靶基因分析48-81
• 4.1 实验材料48
• 4.1.1 动物材料48
• 4.1.2 软件及数据库48
• 4.2 试剂和仪器48
• 4.3 实验方法48-51
• 4.3.1 表达差异基因的筛选和分析48
• 4.3.2 qRT-PCR分析48-51
• 4.3.2.1 Total RNA的提取49
• 4.3.2.2 mRNA的检测和分析49-50
• 4.3.2.3 引物的设计与合成50
• 4.3.2.4 Total RNA的反转录反应50-51
• 4.3.2.5 qRT-PCR反应51
• 4.3.2.6 统计分析51
• 4.4 实验结果51-77
• 4.4.1 mRNA凝胶电泳分析51-52
• 4.4.2 大鼠基因表达谱芯片分析52-73
• 4.4.2.1 细胞组分分析52-57
• 4.4.2.2 生物学过程分析57-63
• 4.4.2.3 分子功能分析63-67
• 4.4.2.4 差异表达基因Pathway分析67-72
• 4.4.2.5 凝血级联信号通路和靶基因72-73
• 4.4.3 qRT-PCR分析73-77
• 4.5 讨论77-81
• 4.5.1 AEE抗血栓作用的基因表达谱分析77-78
• 4.5.2 Fga和Fgb基因研究78
• 4.5.3 Serpinc1基因研究78-79
• 4.5.4 Plaur基因研究79
• 4.5.5 F2基因研究79-81
• 第五章 结论81-82
• 参考文献82-92
• 致谢92-93
• 作者简介93-94
• 导师简介94-96

【参考文献】

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本文编号：304455