人GDF-15的克

发布时间：2017-04-13 22:00

  本文关键词：人GDF-15的克隆、表达条件优化及药理活性的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:对人生长分化因子-15(human growth differentiation factor-15,hGDF-15)成熟肽基因进行克隆,诱导hGDF-15蛋白表达并对部分表达条件进行优化,对建模成功的动物模型注射hGDF-15蛋白观察其作用,为hGDF-15药理活性和生物学功能的研究奠定基础。方法:利用PCR技术克隆人GDF-15成熟肽基因,将其连接到pET-28a载体上构建pET-28a-hGDF-15原核表达载体;在此基础上将其转入Rosetta(DE3)大肠杆菌感受态,获得重组大肠杆菌,分别采用不同温度(16,25,37℃)、不同IPTG浓度(0.1,0.25,0.5,0.75,1mmol/L)和不同时间(12,24,36,48 h)对其进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳,利用Gel Quant Express软件对菌体破碎离心的上清组分和沉淀组分进行含量测定,设计正交试验,分析上清组分和沉淀组分最适诱导表达条件;选用DAB显色法对诱导出的蛋白样品进行Western blot鉴定,利用Ni-Agarose亲和柱对表达产物进行纯化,设置不同浓度的GuNTA(20,40,60,100,500 mmol/L咪唑)洗脱纯化出hGDF-15蛋白,并将纯化后获得hGDF-15蛋白冻干;对实验组动物C57BL/6型小鼠喂养高脂饲料(80%基础饲料,10%猪油,10%蛋黄粉),对照组喂养基础饲料,将体重合格的实验组小鼠注射STZ(100 mg/kg),诱导其成为胰岛素抵抗动物模型,通过皮下给药方式注射hGDF-15蛋白对其进行治疗,观察用药后的血糖变化。结果:成功获得hGDF-15成熟肽基因(339bp);构建了pET-28a-hGDF-15原核表达载体;成功诱导出hGDF-15蛋白;根据正交试验优化出上清组分最适诱导条件为IPTG浓度为0.25 mmol/L、温度为16℃、时间为24 h,沉淀组分最适诱导条件为温度为37℃、时间为36 h、IPTG浓度为1 mmol/L,最高表达量为95.2mg/L;经Western blot鉴定表达产物为hGDF-15蛋白,100mmol/L咪唑的GuNTA成功洗脱出目的蛋白,冻干后经计算纯化后的回收率为29.8%;成功建立高脂胰岛素抵抗C57BL/6小鼠模型,并证明hGDF-15具有一定治疗糖尿病和胰岛素抵抗的作用。结论:成功克隆hGDF-15基因并在大肠杆菌中诱导表达出该蛋白,优化出最适诱导条件,纯化并获得该蛋白,利用该蛋白对高脂胰岛素抵抗动物模型进行治疗,具有一定的效果,这为该蛋白的功能研究提供了实验依据。
【关键词】：生长分化因子-15 原核表达 表达条件优化 高脂动物模型 糖尿病
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96;Q78
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-9
• 前言9
• 第一篇 文献综述9-16
• 1.1 糖尿病9-10
• 1.2 生长分化因子-1510-14
• 1.2.1 hGDF-15的发现10
• 1.2.2 hGDF-15的基因分子结构和表达调控10-12
• 1.2.3 hGDF-15的信号通路12
• 1.2.4 hGDF-15与代谢疾病12-13
• 1.2.5 hGDF-15与糖尿病13
• 1.2.6 hGDF-15其他领域中的研究13-14
• 1.3 糖尿病动物模型14
• 1.4 研究的目的和意义14-16
• 第二篇 研究内容16-62
• 第一章 人GDF-15的克隆及重组质粒的构建16-36
• 1.1 材料16-19
• 1.1.1 质粒载体与工程菌16
• 1.1.2 主要试剂16-17
• 1.1.3 主要仪器17-18
• 1.1.4 公司服务18
• 1.1.5 主要试剂配制18-19
• 1.2 方法19-25
• 1.2.1 hGDF-15成熟肽基因引物设计19
• 1.2.2 hGDF-15成熟肽基因的克隆19-21
• 1.2.3 重组pET-28a-h GDF-15 原核表达载体的构建及鉴定21-25
• 1.2.4 hGDF-15基因序列及生物信息学分析25
• 1.3 结果与分析25-33
• 1.3.1 hGDF-15成熟肽基因的克隆25
• 1.3.2 重组pET-28a-hGDF-15表达载体的鉴定25-26
• 1.3.3 hGDF-15基因序列及生物信息学分析26-33
• 1.4 讨论33-34
• 1.5 小结34-36
• 第二章 人GDF-15蛋白的表达及表达条件优化36-48
• 2.1 材料36-38
• 2.1.1 实验材料36
• 2.1.2 主要试剂36
• 2.1.3 主要仪器36-37
• 2.1.4 主要试剂配制37-38
• 2.2 方法38-40
• 2.2.1 hGDF-15蛋白的诱导表达38
• 2.2.2 hGDF-15蛋白的SDS-PAGE电泳38-39
• 2.2.3 hGDF-15蛋白含量分析及表达条件的优化39-40
• 2.3 结果与分析40-46
• 2.3.1 hGDF-15蛋白诱导表达结果40-44
• 2.3.2 hGDF-15蛋白含量分析及表达条件的优化44-46
• 2.4 讨论46-47
• 2.5 小结47-48
• 第三章 人GDF-15蛋白的鉴定和纯化48-55
• 3.1 材料48-49
• 3.1.1 实验材料48
• 3.1.2 主要试剂48
• 3.1.3 主要仪器48
• 3.1.4 主要试剂配制48-49
• 3.2 方法49-51
• 3.2.1 Western blot鉴定49-50
• 3.2.2 hGDF-15蛋白纯化50-51
• 3.3 结果与分析51-53
• 3.3.1 Western blot鉴定结果51-52
• 3.3.2 hGDF-15蛋白纯化结果52
• 3.3.3 hGDF-15冻干结果52-53
• 3.4 讨论53-54
• 3.5 小结54-55
• 第四章 Ⅱ糖尿病动物模型的建立及人GDF-15蛋白药理活性初步研究55-62
• 4.1 材料55-56
• 4.1.1 实验材料55
• 4.1.2 主要试剂55
• 4.1.3 主要仪器55
• 4.1.4 主要试剂配制55-56
• 4.2 方法56-57
• 4.2.1 高脂动物模型建立方法56
• 4.2.2 Ⅱ型糖尿病模型建立方法56
• 4.2.3 hGDF-15药理活性56-57
• 4.3 结果与分析57-60
• 4.3.1 实验小鼠一般指标57-58
• 4.3.2 高脂组血糖变化58-59
• 4.3.3 hGDF-15药理活性结果59-60
• 4.4 讨论60-61
• 4.5 小结61-62
• 结论62-63
• 参考文献63-68
• 作者简介68-69
• 致谢69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 曹玉珍;张秀英;;高脂饲料诱发C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪肝相关指标的动态观察[J];东北农业大学学报;2011年03期

2 陈梦华;凌宏艳;周寿红;王光;李兴;胡弼;;槟榔碱上调高果糖诱导胰岛素抵抗大鼠骨骼肌GLUT-4和p-PI3K的表达[J];中南医学科学杂志;2012年01期

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  本文关键词：人GDF-15的克隆、表达条件优化及药理活性的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：304544