具有GPx4和ApSOD活性的双功能酶的原核表达及活性研究

发布时间：2017-04-15 23:15

  本文关键词：具有GPx4和ApSOD活性的双功能酶的原核表达及活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：机体生理代谢过程中会产生大量的活性氧(ROS),不同浓度的活性氧会对机体产生有害或有利的影响。低浓度的活性氧可以参与细胞信号转导、刺激细胞增殖以及诱导凋亡等。在某些病理条件下机体会产生大量的活性氧,过量的活性氧会对机体造成严重的影响,如破坏细胞内的蛋白质、DNA等。生物体内存在着一种重要的氧化-抗氧化平衡系统,它是由谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)三类抗氧化酶组成,其作用就是清除机体内多余的ROS以及修复被ROS损伤的的生物大分子,最终使得ROS维持在一个正常的生理水平。生物体内的抗氧化过程极为复杂多变,各种抗氧化酶之间的协同作用显得极为重要。对于单一功能的抗氧化酶的研究已经不能够满足人们对抗氧化酶之间的协同作用的了解,因此开展对于具有协同作用多功能抗氧化酶的研究势在必行。为了制备具有协同作用的GPx4_(mut)和Ap SOD活性的双功能酶,我们选取了一段柔性肽linker(GGGGS),将GPx4_(mut)和Ap SOD基因连接在一起克隆到p Cold I表达载体上,利用缺陷原核表达系统直接制备出重组含GPx4_(mut)-linker-Ap SOD蛋白。GPx4_(mut)基因是由本课题组于扬博士利用快速定点突变将天然GPx4所有中的Cys突变为Ser(Cys2/10/37/66/75/107/148Ser)。(1)双功能酶编码基因的设计我们将GPx4_(mut)基因和Ap SOD基因序列通过一个柔性肽linker(GGGGS)的基因序列连接在一起,获得在大肠杆菌中能够融合GPx4_(mut)和Ap SOD的编码基因序列。(2)p Cold I-Ap SOD表达质粒的构建首先将生工生物工程(上海)股份有限公司合成的克隆到p UC57载体上的Ap SOD基因使用限制性核酸内切酶Ecol RI/Xbal酶切,胶回收获得Ap SOD(Ecol RI/Xbal),同时将p Cold I载体同样使用限制性核酸内切酶Ecol RI/Xbal酶切,胶回收,将Ap SOD(Ecol RI/Xbal)与p Cold I(Ecol RI/Xbal)连接,最终获得p Cold I-Ap SOD表达载体。(3)p Cold I-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD表达质粒的构建我们以p Cold I-GPx4_(mut)为模板,通过设计下游引物,利用PCR技术将linker(GGGGS)编码基因连接到GPx4_(mut)的3’端,胶回收后获得GPx4_(mut)-linker目的基因。使用限制性核酸内切酶Nde I/Bam HI将GPx4_(mut)-linker目的基因和p Cold I-Ap SOD进行双酶切,最终将二者连接在一起构建出p Cold I-GPx4_(mut)linker-Ap SOD表达质粒。(4)目的蛋白的表达及纯化将p Cold I-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD表达质粒转化至BL21(DE3)cys半胱氨酸缺陷型大肠杆菌菌株中,获得含有p Cold I-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD质粒的缺陷表达菌株BL21(DE3)cys-p Cold I-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD。将p Mza F质粒转化至该缺陷表达菌中,在15℃低温培养箱中诱导表达过夜,利用Ni~(2+)螯合层析纯化目的蛋白,最终获得Se-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD蛋白。(5)Se-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD的GPx和SOD活力的测定活力测定结果显示,Se-Cu/Zn-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD的SOD活力86.2U/mg,Nonseleno-Cu/Zn-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD的SOD活力135.8U/mg,Nonseleno-Cu/Zn-Ap SOD的SOD活力454.8U/mg。Se-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD的GPx活力为6.1 U/mg,低于Se-GPx4_(mut)(21.5U/mg)的活力,但仍高于小分子模拟物Ebselen。综上所述,我们利用基因工程方法成功制备出具有GPx和SOD活性的双功能酶,这种双攻酶不仅对阐明酶的相互协作作用有着重要的意义,而且具有潜在的药用价值。
【关键词】：谷胱甘肽过氧化物酶 超氧化物歧化酶 双功能酶 半胱氨酸缺陷型表达系统 SPP低温表达系统
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文缩写词表11-13
• 第一章 绪论13-25
• 1.1 谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）14-19
• 1.1.1 GPx分类15-16
• 1.1.2 GPx结构16-17
• 1.1.3 GPx催化机制17-19
• 1.1.3.1 乒乓机制17-18
• 1.1.3.2 顺序机制18-19
• 1.2 超氧化物歧化酶（SOD）19-23
• 1.2.1 SOD种类与分布19-20
• 1.2.2 SOD的结构20-21
• 1.2.3 SOD的理化性质21-22
• 1.2.3.1 SOD对氰化物和H_2O_2敏感21-22
• 1.2.3.2 SOD的吸收光谱特性22
• 1.2.3.3 SOD是亲水性的蛋白质22
• 1.2.4 SOD的催化机理22-23
• 1.3 具有GPx和ApSOD活性的双功能抗氧化酶23
• 1.4 立论依据23-25
• 第二章 实验材料和方法25-36
• 2.1 序言25-26
• 2.2 实验材料26-29
• 2.2.1 实验试剂26-27
• 2.2.2 实验仪器27
• 2.2.3 菌株与质粒27
• 2.2.4 溶液配制27-29
• 2.3 实验方法29-36
• 2.3.1 pCold I -ApSOD质粒的构建29-30
• 2.3.2 CaCl_2法制备感受态细菌30
• 2.3.3 重组质粒的筛选30
• 2.3.4 PCR扩增GPx4_(mut)-linker目的片段30-31
• 2.3.5 pCold I-GPx4_(mut)-linker-ApSOD质粒的构建31-32
• 2.3.6 pCold I-GPx4_(mut)-linker-ApSOD重组质粒的筛选32
• 2.3.7 表达菌株的构建32
• 2.3.8 普通蛋白的表达32
• 2.3.9 缺陷表达菌株的构建32-33
• 2.3.10 含硒蛋白的表达33
• 2.3.11 Ni~(2+)螯合层析纯化目的蛋白33-34
• 2.3.12 纯化产物的SDS-PAGE及Western Blot分析34
• 2.3.13 蛋白含量的测定34
• 2.3.14 GPx4活力测定34
• 2.3.15 Cu~(2+)、Zn~(2+)引入34
• 2.3.16 ApSOD活力的测定34-36
• 第三章 实验结果36-41
• 3.1 pCold I- ApSOD质粒的构建36
• 3.2 PCR扩增GPx4_(mut)-linker目的片段36-37
• 3.3 pCold I-GPx4_(mut)-linker-ApSOD质粒的构建37-38
• 3.4 普通蛋白表达38
• 3.5 含硒蛋白的表达及纯化38-40
• 3.6 Se-GPx4_(mut)-linker-ApSOD和Se-GPx4_(mut)的GPx活力测定40
• 3.7 Se- GPx4_(mut)-linker-ApSOD和Nonseleno-ApSOD的SOD活力的测定40-41
• 第四章 讨论41-43
• 第五章 总结43-44
• 攻读硕士期间取得的成绩44-45
• 参考文献45-51
• 致谢51

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