以中链脂肪酸受体GPR84为靶点的药物高通量筛选模型的建立和应用

发布时间：2017-04-18 21:04

  本文关键词：以中链脂肪酸受体GPR84为靶点的药物高通量筛选模型的建立和应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：G蛋白偶联受体84(GPR84)是C9-C14的中链脂肪酸受体,不仅在脂肪酸代谢和机体免疫反应发挥着重要作用,而且与肠炎、多发性硬化症、内毒素血症等炎症性免疫疾病有着密切联系。由于GPR84是一种促进炎症发生的受体,因此,找到以GPR84为靶点的拮抗剂,可能为治疗这些疾病提供一种有效的方法。迄今为止针对G蛋白偶联受体常用的药物筛选方法有两种,一种是针对受体的配体竞争结合实验,另外一种是依赖于GPCR下游信号通路(如cAMP, Ca2+)的功能性实验。在GPCR激活后,可以活化Gαq亚基中的Gα16,通过一系列的信号转导后,可以升高胞内肌醇三磷酸(IP3)的浓度,继而引起内质网膜上的钙离子释放,通过检测胞质中钙离子浓度的变化,可以推断出受体被激活的水平。本文将含GPR84和Gα16基因质粒共转染到HEK293细胞中,经过抗生素抗性筛选,挑取稳定表达GPR84蛋白的HEK293细胞系。用RT-PCR、免疫荧光染色等实验方法检测了GPR84基因和其编码受体蛋白的表达；用钙流实验、cAMP实验、Western blot实验、FACS实验证实了表达的GPR84具有完整的生物学活性,并利用该细胞系进行了药物高通量筛,得到了新的GPR84拮抗剂,为进一步阐明GPR84的生物学功能,研究并治疗与其相关免疫疾病奠定了基础。建立HEK293/GPR84/ Gα16稳转细胞系。方法：将编码GPR84和Gα16蛋白的质粒电转至HEK293细胞之中,利用抗生素抗性筛选28天,选择稳定生长的单克隆扩大培养,得到单克隆之后,利用RT-PCR和免疫荧光染色的实验方法检测了外源基因和表达的受体蛋白,结果：RT-PCR和免疫荧光染色均检测到GPR84蛋白的表达,证明获得的细胞系膜表面稳定表达GPR84受体。检测获得的HEK293/GPR84/Gα16稳转细胞系上GPR84活性及功能。方法：利用钙流实验、cAMP实验和Western blot实验的方法检测GPR84的配体6-OAU对本细胞株上稳定表达的GPR84具有激动作用；利用钙流实验、FACS实验和免疫荧光染色实验检测了在6-OAU刺激后,本细胞株膜表面上的GPR84受体脱敏,并发生内吞现象。结果：GPR84能被6-OAU呈剂量依赖性地激活,说明建立的稳转细胞系膜表面上的GPR84具有完整的生物学功能。建立高通量钙流筛选模型及其应用。方法：(1)高通量钙流模型分为两种模型：激动剂模型及拮抗剂模型,即可分别评价6-OAU和小分子化合物对GPR84受体的作用；(2)应用拮抗剂模型检测了国家化合物样品库中的一系列化合物对GPR84的作用。结果：6-OAU能剂量依赖地激活趋化因子受体GPR84,在激动剂模型中检测到显著的钙离子变化信号,而应用拮抗剂模型,筛选小分子化合物能否抑制6-OAU引起的钙离子变化,初步得到了对趋化因子受体GPR84有一定拮抗作用的化合物ZQ-02,并验证了该化合物对GPR84的拮抗活性和特异性。
【关键词】：GPR84 G蛋白偶联受体 稳定表达 拮抗剂 钙流实验 高通量筛
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 绪论12-21
• 1.1 G蛋白偶联受体12-16
• 1.1.1 GPCRs的结构与分类12-13
• 1.1.2 基于GPCRs的信号传导系统13-16
• 1.1.3 以G蛋白偶联受体为靶点的药物开发以及市场前景16
• 1.2 中链脂肪酸受体GPR84概述16-21
• 1.2.1 游离脂肪酸受体及其分类16-17
• 1.2.2 GPR84的功能及其配体17-19
• 1.2.3 GPR84与疾病19-21
• 第二章 研究目的与内容21-23
• 2.1 研究目的21
• 2.2 研究内容21-23
• 第三章 材料与方法23-35
• 3.1 实验材料23-30
• 3.1.1 质粒和细胞株23
• 3.1.2 试剂及耗材23-24
• 3.1.3 仪器24-26
• 3.1.4 试剂配制26-30
• 3.2 实验方法30-35
• 3.2.1 细胞转染和稳转细胞系构建30
• 3.2.2 RT-PCR30-31
• 3.2.3 钙流实验31
• 3.2.4 环腺苷酸(cAMP)实验31-32
• 3.2.5 免疫荧光染色32
• 3.2.6 流式细胞分析(FACS)32
• 3.2.7 Western blot检测ERK磷酸化水平32-33
• 3.2.8 GPR84拮抗剂的高通量筛选33-34
• 3.2.9 数据处理及分析34-35
• 第四章 结果与分析35-44
• 4.1 构建稳定表达GPR84/Gα16蛋白的HEK293细胞株35
• 4.2 GPR84基因表达及其受体蛋白定位35-36
• 4.3 6-OAU提高GPR84介导的细胞质内Ca~(2+)浓度36
• 4.4 6-OAU通过GPR84降低细胞内cAMP水平36-37
• 4.5 6-OAU通过激活GPR84导致ERK磷酸化37-38
• 4.6 6-OAU诱导GPR84发生脱敏现象38-39
• 4.7 6-OAU诱导GPR84发生内吞现象39-40
• 4.8 GPR84拮抗剂的高通量筛选(初筛)40-41
• 4.9 GPR84拮抗剂的复筛及其活性验证41-44
• 第五章 结论及意义44-46
• 参考文献46-49
• 在学期间所取得的科研成果49-50
• 致谢50

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