自由基清除剂Tempol的抗缺氧作用及其分子机制研究

发布时间：2017-05-02 05:02

  本文关键词：自由基清除剂Tempol的抗缺氧作用及其分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：1.通过整体动物实验考察Tempol的抗缺氧作用,评价Tempol对缺氧小鼠的保护作用,初步阐述Tempol的抗缺氧机制。 2.建立PC12细胞、H9C2细胞缺氧模型,从神经保护与心肌保护两方面考察缺氧对细胞的损伤作用,筛选Tempol作用于两种缺氧细胞的最佳浓度,初步探讨Tempol对缺氧细胞保护的分子机制。 3.以HIF-1α为中心,通过研究HIF-1α、抗氧化体系、ROS、凋亡的关系,进一步探讨Tempol保护缺氧H9C2细胞可能的分子机制。 方法：1.采用小鼠常压密闭缺氧实验,考察Tempol对缺氧小鼠存活时间的影响,确定Tempol的抗缺氧作用,然后采用低压氧舱模拟急进高原缺氧环境,对小鼠心肌与脑组织相关缺氧与生化指标LD、LDH、SOD、MDA进行测定,初步阐述Tempol的抗缺氧机制。 2.在缺氧条件下培养PC12细胞、H9C2细胞,观察缺氧对细胞形态的影响,评价缺氧对细胞的损伤情况；通过MTT法筛选Tempol作用于缺氧细胞的最佳浓度,对缺氧细胞内ROS、SOD、MDA、LDH、T-AOC进行测定,采用实时荧光定量PCR法对缺氧细胞内HIF-1α、VEGF、Caspase-3mRNA表达进行检测,采用Western-blot法对缺氧细胞内HIF-1α、VEGF蛋白表达进行检测。 3.用YC-1阻断HIF-1α表达,考察Tempol作用于缺氧H9C2细胞后,对ROS、HIF-1α、SOD、CAT以及细胞凋亡的影响,进一步研究Tempol可能的抗缺氧机制。 结果：1.小鼠常压密闭缺氧实验结果显示,Tempol低、中、高剂量均能够显著的延长缺氧小鼠的存活时间(P0.01),高剂量组延长率达到了64.3%,延长时间比作为阳性药的乙酰唑胺时间长,说明Tempol对缺氧小鼠具有较好的保护作用。 模拟高原缺氧实验结果显示,与正常组相比较,缺氧能够升高心肌、脑组织内LD、LDH、MDA的含量(P0.01),降低SOD的活性(P0.01),经Tempol预处理后,缺氧小鼠组织内LD、LDH、MDA含量有所降低(P0.01),SOD活性显著的升高(P0.01)。 2.缺氧环境能明显抑制PC12、H9C2细胞的活性,Tempol终浓度为1×10-(?)mol·L-1能够显著增加细胞的存活率(P0.01),降低培养基中LDH的含量(P0.01),有效保护细胞膜的完整性；能够增加细胞内SOD、T-AOC活力(P0.01),提高抗氧化能力,减少自由基与MDA的堆积(P0.01)：此外,Tempol还能够降低心肌细胞系H9C2细胞内特异性指标CK的活力(P0.01),减少细胞的凋亡,提高细胞的存活率。 与缺氧模型组相比较,Tempol在缺氧36h后能够显著升高PC12细胞HIF-la. VEGF mRNA与蛋白的表达水平(P0.01),在缺氧12h后能够显著的降低缺氧PC12细胞内Caspase-3mRNA的表达(P0.01)。 与缺氧模型组相比较,Tempol在缺氧24h后能够显著升高缺氧H9C2细胞HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表达(P0.01),降低Caspase-3mRNA的表达(P0.01)。 3.YC-1终浓度为4×10-5mol·L-1寸能够有效阻断缺氧后H9C2细胞内HIF-1α的表达,从而导致缺氧H9C2细胞内VEGF. SOD. CAT表达也有所降低：Tempol能够升高YC-1阻断HIF-1α后H9C2细胞内HIF-1α、VEGF、SOD、CAT mRNA与蛋白的表达,降低Caspase-3mRNA与蛋白的表达,降低细胞凋亡结论：1.动物缺氧实验结果表明,Tempol具有抗缺氧作用,其机制可能是通过升高SOD的活性,降低LD、LDH、MDA的含量来实现的。 2Tempol对缺氧PC12细胞和H9C2细胞具有明显的保护作用,其机制可能是通过清除胞内产生的过多的ROS,增加胞内抗氧化能力,降低脂质过氧化产物的堆积,保护细胞膜的完整性,升高HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表达,降低Caspase-3的表达,降低细胞的凋亡来实现的。 3.Tempol对缺氧H9C2细胞的保护机制很可能是通过升高HIF-1α表达,激活部分VEGF、SOD、CAT的高表达,增加抗氧化能力,清除过多自由基,降低细胞的凋亡来实现的,具体机制有待更进一步的研究。
【关键词】：Tempol PC12细胞 H9C2细胞 抗缺氧 抗氧化 HIF-1a ROS
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R966
【目录】：

• 英文缩略词表3-4
• 中文摘要4-6
• Abstract6-14
• 第一章 研究背景与研究内容14-26
• 1.1 研究背景14-21
• 1.1.1 研究意义14-15
• 1.1.2 国内外研究概况15-21
• 1.2 研究内容和技术路线21-23
• 1.2.1 研究内容21-22
• 1.2.2 技术路线22-23
• 参考文献23-26
• 第二章 Tempol抗缺氧药效学研究26-33
• 摘要26-27
• 2.1 材料27
• 2.1.1 主要材料27
• 2.1.2 主要仪器27
• 2.2 方法27-28
• 2.2.1 小鼠常压密闭缺氧实验27-28
• 2.2.2 模拟8000m急性高原缺氧实验28
• 2.2.3 统计方法28
• 2.3 实验结果28-30
• 2.3.1 小鼠常压密闭缺氧实验28-29
• 2.3.2 模拟8000m急性高原缺氧实验29-30
• 2.4 结论30-32
• 参考文献32-33
• 第三章 Tempol对缺氧PC12细胞的保护作用及其机制研究33-52
• 摘要33-34
• 3.1 材料34-35
• 3.1.1 主要材料34
• 3.1.2 主要仪器34-35
• 3.1.3 试剂的配制35
• 3.2 方法35-38
• 3.2.1 PC12细胞培养35
• 3.2.2 PC12细胞缺氧处理35
• 3.2.3 HE染色观察Tempol对缺氧PC12细胞形态的影响35-36
• 3.2.4 MTT法检测Tempol对缺氧PC12细胞活性的影响36
• 3.2.5 Tempol对缺氧PC12细胞中ROS含量的影响36
• 3.2.6 Tempol对缺氧PC12细胞LDH、SOD、MDA、T-AOC的影响36
• 3.2.7 Tempol对缺氧PC12细胞缺氧相关基因表达的影响36-37
• 3.2.8 Tempol对缺氧PC12细胞HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响37
• 3.2.9 统计学方法37-38
• 3.3 结果38-49
• 3.3.1 缺氧对PC12细胞形态的影响38
• 3.3.2 MTT法检测缺氧环境对PC12细胞活性的影响38-39
• 3.3.3 MTT法检测Tempol对缺氧PC12细胞活力的影响39
• 3.3.4 HE染色观察Tempol对缺氧PC12细胞形态的影响39-40
• 3.3.5 Tempol对缺氧PC12细胞ROS含量的影响40-42
• 3.3.6 Tempol对缺氧PC12细胞LDH的影响42
• 3.3.7 Tempol对缺氧PC12细胞SOD的影响42-43
• 3.3.8 Tempol对缺氧PC12细胞T-AOC的影响43-44
• 3.3.9 Tempol对缺氧PC12细胞MDA的影响44
• 3.3.10 Tempol对缺氧PC12细胞HIF-1α mRNA表达的影响44-45
• 3.3.11 Tempol对缺氧PC12细胞VEGF mRNA表达的影响45-46
• 3.3.12 Tempol对缺氧PC12细胞Caspase-3 mRNA表达的影响46-47
• 3.3.13 Tempol对缺氧PC12细胞HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响47-49
• 3.4 结论49-51
• 参考文献51-52
• 第四章 Tempol对缺氧H9C2细胞的保护作用及其机制研究52-70
• 摘要52-53
• 4.1 材料53-54
• 4.1.1 主要材料53
• 4.1.2 主要仪器53
• 4.1.3 试剂的配制53-54
• 4.2 方法54-55
• 4.2.1 H9C2细胞培养54
• 4.2.2 H9C2细胞缺氧处理54
• 4.2.3 缺氧H9C2细胞形态观察54
• 4.2.4 MTT法检测Tempol对缺氧H9C2细胞活性的影响54
• 4.2.5 Tempol对缺氧H9C2细胞ROS含量的影响54-55
• 4.2.6 Tempol对缺氧H9C2细胞LDH、SOD、MDA、T-AOC、CK的影响55
• 4.2.7 Tempol对缺氧H9C2细胞缺氧相关基因表达的影响55
• 4.2.8 统计学方法55
• 4.3 结果55-67
• 4.3.1 缺氧不同时间对H9C2细胞活力的影响56
• 4.3.2 MTT法检测Tempol对缺氧H9C2细胞活性的影响56-57
• 4.3.3 Tempol对缺氧H9C2细胞形态的影响57
• 4.3.4 Tempol对缺氧H9C2细胞ROS含量的影响57-59
• 4.3.5 Tempol对缺氧H9C2细胞LDH的影响59-60
• 4.3.6 Tempol对缺氧H9C2细胞SOD的影响60
• 4.3.7 Tempol对缺氧H9C2细胞T-AOC的影响60-62
• 4.3.9 Tempol对缺氧H9C2细胞CK的影响62
• 4.3.10 Tempol对缺氧H9C2细胞HIF-1α mRNA表达的影响62-63
• 4.3.11 Tempol对缺氧H9C2细胞VEGF mRNA表达的影响63-64
• 4.3.12 Tempol对缺氧H9C2细胞Caspase-3 mRNA表达的影响64-65
• 4.3.13 Tempol对缺氧H9C2细胞HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响65-67
• 4.4 结论67-69
• 参考文献69-70
• 第五章 Tempol对缺氧H9C2细胞内HIF-1α-抗氧化体系-ROS与细胞凋亡的影响70-89
• 摘要70-71
• 5.1 材料71
• 5.1.1 主要材料71
• 5.1.2 主要仪器71
• 5.1.3 试剂配制71
• 5.2 方法71-74
• 5.2.1 实验分组71-72
• 5.2.2 阻断剂YC-1浓度的筛选72
• 5.2.3 Tempol对缺氧H9C2细胞内YC-1阻断HIF-1α后ROS的影响72
• 5.2.4 Tempol对缺氧H9C2细胞内YC-1阻断HIF-1α后HIF-1α、VEGF、CAT、SOD、Caspase-3 mRNA的影响72-73
• 5.2.5 Tempol对缺氧H9C2细胞内YC-1阻断HIF-1α后HIF-1α、VEGF、SOD、CAT、Caspase-3蛋白表达的影响73
• 5.2.6 Tempol对缺氧H9C2细胞内YC-1阻断HIF-1α后细胞凋亡率的影响73-74
• 5.2.7 统计学方法74
• 5.3 结果74-85
• 5.3.1 阻断剂YC-1浓度的筛选74-75
• 5.3.2 Tempol对缺氧H9C2细胞内YC-1阻断HIF-1α后ROS的影响75-77
• 5.3.3 Tempol对缺氧H9C2细胞内YC-1阻断HIF-1α后HIF-1α、VEGF、CAT、SOD、Caspase-3 mRNA的影响77-80
• 5.3.4 Tempol对缺氧H9C2细胞内YC-1阻断HIF-1α后HIF-1α、VEGF、CAT、SOD、Caspase-3蛋白表达的影响80-84
• 5.3.5 Tempol对缺氧H9C2细胞内YC-1阻断HIF-1α后细胞凋亡率的影响84-85
• 5.4 结论85-88
• 参考文献88-89
• 硕士期间发表的论文及参与的科研工作89-90
• 致谢90

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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  本文关键词：自由基清除剂Tempol的抗缺氧作用及其分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：340298