靶向性p53融合蛋白的制备、检测与功能分析

发布时间：2017-05-02 23:14

  本文关键词：靶向性p53融合蛋白的制备、检测与功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：生物药物是一类采用现代生物技术而得到的用于预防、治疗和诊断的药物。因其具有药理活性高、毒副作用小、营养价值高、治疗针对性强的特点而成为21世纪最有发展潜力的新兴药物。因此国内外医药学领域高度重视生物药物的研发和制备,而对其分析鉴定和检测则是将其推广至临床应用的基础。p53基因是一个重要的抑癌基因,它编码的p53蛋白在识别和修复DNA损伤、抑制细胞恶性增殖、促进细胞凋亡和诱导细胞周期阻滞方面发挥重要作用。野生型p53基因的缺失会导致肿瘤的发生,然后细胞出现生长、凋亡和DNA修复功能的紊乱。据报道称,25%-35%的癌性神经细胞和70%-76%的胶质瘤细胞会出现p53基因的突变,所以恢复细胞中的p53蛋白功能被认为是神经肿瘤治疗的一种方法。由于p53蛋白的制备、检测及功能分析是其用于肿瘤治疗的基础,常规的检测方法如ELISA、Western blot等只能对p53蛋白进行定性和定量分析,不能保证其生物活性,因此需要既能保证蛋白准确性又能检测其功能的方法来分析检测p53。p53蛋白细胞渗透性较低,仅靠自身难以穿过细胞膜进入神经肿瘤细胞,这使得p53蛋白的应用受到了一定限制。因此可考虑p53蛋白与具有穿膜效应的多肽结合来提高p53蛋白的转运效率。我们实验组前期发现一个新型衍生肽,命名为RDP (RVG-derived peptides),它的部分序列来源于狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein, RVG)嗜神经性的关键片段。实验发现其能携带BDNF蛋白及基因快速特异性地进入脑内并发挥功能,因此考虑将RDP与p53蛋白通过化学键连接,确定其分析方法并检测p53蛋白在细胞内的生物学功能,从而希望为抑制神经系统肿瘤,如恶性脑胶质瘤的生长增殖提供一种新的方法。本文主要分三个部分进行,第一部分：利用基因工程技术构建重组质粒pET28a-p53,将p53基因连接至pET28a中。优化了p53蛋白的制备条件,SDS-PAGE分析了p53蛋白的准确性,Folin-酚法对p53蛋白的含量进行测定,然后分别制备并纯化了靶向性p53融合蛋白和p53蛋白。第二部分：分别合成了荧光染料FITC和罗丹明B异硫氰酸酯(RhoB)标记的靶向性p53融合蛋白和p53蛋白,并采用荧光分光光度法分析了该蛋白的荧光强度,然后通过细胞实验和小动物活体成像分析检测了靶向性p53蛋白的细胞选择性和入脑可行性。第三部分：对靶向性p53融合蛋白的功能进行分析。通过MTT法检测靶向性p53融合蛋白的生物活性,并采用凋亡与坏死检测、流式细胞仪来探究靶向性p53融合蛋白的作用机制。实验结果表明靶向性p53融合蛋白不仅对神经肿瘤细胞的选择性更高,而且具有生物活性。这说明通过生物技术制备的靶向性p53融合蛋白既不会干扰RDP的生物功能也不会损害p53蛋白的活性,这可能为抑制神经肿瘤细胞的生长增殖提供了一种简单有效的新方式。
【关键词】：生物药物分析 靶向性p53 制备条件优化 细胞选择性 活性分析
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943;R917
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 第一章 文献综述9-17
• 1.1 中枢神经系统肿瘤9-12
• 1.2 p53的抗肿瘤作用及其检测方法12-15
• 1.3 细胞穿膜肽概述15-17
• 第二章 绪论17-19
• 第三章 p53蛋白的制备及含量分析19-37
• 3.1 实验材料19-21
• 3.1.1 菌种与载体19
• 3.1.2 主要试剂和仪器19-20
• 3.1.3 主要试剂的配制20-21
• 3.2 实验方法21-29
• 3.2.1 载体构建21-27
• 3.2.2 制备条件的优化、纯化、SDS-PAGE及蛋白含量检测27-29
• 3.3 结果29-35
• 3.3.1 基因产物的分析与鉴定29
• 3.3.3 基因测序分析29-32
• 3.3.4 标准曲线的绘制32
• 3.3.5 SDS-PAGE32-35
• 3.4 结论与分析35-37
• 第四章 靶向性p53融合蛋白的细胞特异性鉴定37-45
• 4.1 实验材料37-38
• 4.1.1 细胞株37
• 4.1.2 主要试剂和仪器37-38
• 4.1.3 主要试剂的配制38
• 4.2 实验方法38-39
• 4.2.1 FITC和罗丹明B异硫氰酸酯荧光标记蛋白的合成38
• 4.2.2 SH-SY5Y和HepG-2细胞的培养38-39
• 4.2.3 靶向性p53融合蛋白的细胞选择性分析39
• 4.2.4 靶向性p53融合蛋白的活体成像检测39
• 4.3 结果39-42
• 4.3.0 FITC和罗丹明B异硫氰酸酯荧光标记蛋白的荧光强度测定39-40
• 4.3.1 靶向性p53融合蛋白的细胞选择性分析40-41
• 4.3.2 靶向性p53融合蛋白的活体成像检测41-42
• 4.4 结论与分析42-45
• 第五章 靶向性p53融合蛋白的功能检测及其机制研究45-53
• 5.1 实验材料45-46
• 5.1.1 细胞株45
• 5.1.2 主要试剂和仪器45-46
• 5.1.3 主要试剂的配制46
• 5.2 实验方法46-47
• 5.2.1 SH-SY5Y和U251细胞的培养46
• 5.2.2 靶向性p53融合蛋白的细胞活性鉴定46
• 5.2.3 细胞凋亡与坏死的检测46-47
• 5.2.4 流式细胞仪分析细胞凋亡47
• 5.2.5 细胞周期检测分析47
• 5.2.6 统计学分析47
• 5.3 结果47-51
• 5.3.1 靶向性p53融合蛋白的活性检测47-48
• 5.3.2 靶向性p53融合蛋白的作用机制分析48-50
• 5.3.3 靶向性p53融合蛋白功能的进一步确证50-51
• 5.4 结论与分析51-53
• 第六章 结论53-55
• 参考文献55-61
• 英文缩略说明61-63
• 附录63-65
• 致谢65-67
• 在读期间发表论文67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 孙立超;李蕴潜;宋红梅;朱战鹏;徐保锋;马程远;邱吉庆;;P16功能性短肽对C6和U251细胞增殖的抑制作用[J];吉林大学学报(医学版);2011年02期

2 孙 兵;神经干细胞与脑肿瘤基因治疗[J];国外医学.神经病学神经外科学分册;2002年03期

3 武军华;魏文清;贾培媛;王晨宇;赵宇;刘晶;黄春倩;王玉霞;;竞争性ELISA方法检测小鼠血清中的P53蛋白[J];国际药学研究杂志;2011年01期

4 付爱玲;赵宝全;陈亨宇;战丽萍;;细胞穿透肽介导外源物质入胞转运研究进度[J];国际药学研究杂志;2012年02期

5 刘丽华;张明;;替莫唑胺诱导大鼠脑胶质瘤C6细胞caspase非依赖的程序性死亡[J];南方医科大学学报;2015年02期

6 叶姣,陈长华,夏杰,付水林,杨雅琴;温度对重组大肠杆菌生长及外源蛋白表达的影响[J];华东理工大学学报;2002年04期

7 张道宝;张列;余水;刘艳辉;刘家刚;相静;毛庆;;伽玛刀治疗后P53蛋白和PCNA蛋白在复发胶质母细胞瘤中表达的变化及其临床意义[J];华西医学;2009年06期

8 肖荣刚;许佳俊;王晶;刘博;刘丽;孙君盈;王丽华;;荧光引导下行脑恶性胶质瘤切除术患者的护理[J];解放军护理杂志;2011年19期

9 路戈,刘春霞,计融;玉米赤霉烯酮单克隆抗体酶联免疫测定方法的建立及初步应用[J];真菌学报;1996年04期

10 陈娟;卢光t;;CIK细胞的生物特性和应用研究新进展[J];肿瘤药学;2014年03期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 冯延叶;变性蛋白复性装置研制及包涵体蛋白变性和复性技术研究[D];华东理工大学;2013年

  本文关键词：靶向性p53融合蛋白的制备、检测与功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：341896