多西他赛影响内皮细胞生物学行为及抑制其迁移机制的研究

发布时间：2017-05-09 17:13

  本文关键词：多西他赛影响内皮细胞生物学行为及抑制其迁移机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：冠状动脉疾病(CAD)一直是威胁人类健康的几大杀手之一,目前最好的治疗手段是在病变部位置入药物洗脱支架(DESs),可一定程度上减少血管再狭窄的几率。但临床结果表明,DESs虽降低了血管再狭窄,却大大延迟了支架内皮化的时间,治疗效果不理想。究其原因,DESs上携带的抗增殖类药物的使用,这类药物多为紫杉醇及其衍生物等,他们大多无细胞特异性,在抑制中膜细胞增殖的同时;也抑制了内膜细胞的增殖,使损伤的内膜未能快速修复。然而这些药物延迟内皮化的详细机理却不清楚,特别是如何延迟内皮细胞快速迁移至损伤位点的机制。基于此,本研究以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为细胞模型,体外探究紫杉醇的类似物多西他赛(DTX)对HUVECs的影响及其作用机制,重点关注细胞运动和迁移的经典信号通路ROCK是否参与了DTX相关的HUVECs迁移。试图揭示DTX延迟内皮化的原因,探究快速内皮化潜在靶点,且为DTX的临床应用提供更广泛的理论依据。主要研究结果如下:1 DTX影响HUVECs生物学行为的浓度依赖性:细胞增殖结果表明,中等剂量的DTX(0.5 ng/ml,5 ng/ml)即可显著抑制HUVECs的增殖且具有浓度和时间依赖性;流式细胞仪检测表明,高剂量的DTX(50 ng/ml)出现了明显的细胞毒性,显著促进了细胞的凋亡(包括早期凋亡,晚期凋亡和坏死);细胞粘附结果表明,DTX仅延迟了细胞的粘附时间并未影响其粘附总数;单个HUVECs(活细胞工作站)和群体细胞(划痕法和transwell法)的运动和迁移结果表明,低剂量的DTX(0.05 ng/ml)可显著抑制单个细胞和群体细胞的迁移。表明DTX抑制HUVECs迁移的效应更加敏感。2 DTX影响细胞增殖和的凋亡相关基因的表达:采用免疫荧光和免疫印迹方法分别对反映细胞增殖情况的蛋白PCNA和表征细胞凋亡的蛋白p53的表达水平进行了定性定量分析。研究结果表明:DTX浓度愈高,PCNA的表达越低且p53的表达越高,说明DTX通过促进促凋亡基因p53的表达加速了细胞的凋亡,这种效应在DTX的浓度为50 ng/ml时最为显著。3 DTX抑制HUVECs迁移的机制:DTX显著抑制了黏着斑蛋白Integrinβ1的表达,降低了ROCK信号通路中MLC的磷酸化水平,且在ROCK的抑制剂Y-27632预处理细胞后这种效应愈加显著,还大大降低了细胞的迁移数目。说明DTX可能是通过Integrinβ1-ROCK-(p)MLC信号通路抑制细胞的迁移。4 DTX影响了HUVECs的功能:免疫荧光和免疫印迹定性定量研究表明,中等剂量的DTX(5 ng/ml)显著抑制了HUVECs细胞间粘附因子PECAM-1的表达,表明其在一定程度上减弱了细胞间紧密程度,使得细胞间的粘附力降低。此外,DTX还显著降低了HUVECs分泌NO的能力,表明DTX破坏了血管正常的收缩和舒张。
【关键词】：内皮化延迟 多西他赛 内皮细胞 细胞行为 迁移机制
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-7
• 主要缩略词表7-11
• 1 绪论11-21
• 1.1 内皮化延迟是诱发血管再狭窄的重要原因11
• 1.2 抑制血管再狭窄的药物11-13
• 1.2.1 抗再狭窄药物的分类11-13
• 1.2.2 抗增殖药物的应用瓶颈13
• 1.3 多西他赛在心血管疾病中的研究现状13-17
• 1.3.1 多西他赛的作用机制13-14
• 1.3.2 多西他赛抑制内膜增生14-15
• 1.3.3 多西他赛抑制血管新生15-16
• 1.3.4 多西他赛抑制血管内皮细胞的迁移16-17
• 1.4 研究内容、意义及技术路线17-19
• 1.4.1 研究内容17-18
• 1.4.2 问题的提出和研究意义18-19
• 1.5 技术路线19-21
• 2 多西他赛影响内皮细胞生物学行为的浓度依赖性21-29
• 2.1 引言21
• 2.2 仪器、耗材和试剂21-22
• 2.3 实验方法22-23
• 2.3.1 人脐静脉内皮细胞的培养22
• 2.3.2 细胞的增殖22-23
• 2.3.3 细胞的凋亡23
• 2.3.4 统计分析23
• 2.4 实验结果23-27
• 2.4.1 多西他赛对内皮细胞增殖的抑制作用呈现浓度和时间依赖行为23-26
• 2.4.2 多西他赛促进细胞凋亡且成浓度依赖性26-27
• 2.5 小结与讨论27-29
• 3 多西他赛对内皮细胞铺展，，运动和迁移的影响29-39
• 3.1 引言29
• 3.2 仪器、耗材和试剂29-30
• 3.3 实验方法30-32
• 3.3.1 细胞的粘附30
• 3.3.2 群体细胞的迁移30-31
• 3.3.3 单个细胞的迁移31-32
• 3.4 实验结果32-37
• 3.4.1 多西他赛延迟了内皮细胞的粘附32-34
• 3.4.2 多西他赛抑制群体细胞迁移呈浓度依赖性34-36
• 3.4.3 多西他赛抑制单个细胞的迁移呈浓度依赖性36-37
• 3.5 小结与讨论37-39
• 4 多西他赛影响血管内皮细胞铺展，运动和迁移的机制39-53
• 4.1 引言39-40
• 4.2 材料、试剂和仪器40-41
• 4.3 实验方法41-43
• 4.3.1 免疫荧光41-42
• 4.3.2 免疫印迹42-43
• 4.3.3 细胞的迁移43
• 4.4 实验结果43-49
• 4.4.1 多西他赛抑制细胞中Integrin β1 的表达且降低了MLC的磷酸化水平43-46
• 4.4.2 多西他赛通过降低内皮细胞MLC的磷酸化水平抑制其迁移46-47
• 4.4.3 多西他赛通过抑制PCNA的表达抑制内皮细胞的增殖47-49
• 4.4.4 多西他赛通过P53基因的表达促进内皮细胞的凋亡49
• 4.5 小结与讨论49-53
• 5 多西他赛对血管内皮细胞功能的影响53-63
• 5.1 引言53
• 5.2 材料、试剂和仪器53-55
• 5.3 实验方法55-56
• 5.3.1 免疫荧光和免疫印迹55
• 5.3.2 VEGF分泌的ELISA检测55
• 5.3.3 NO的分泌情况55
• 5.3.4 总抗氧化（SOD）能力55-56
• 5.4 实验结果56-60
• 5.4.1 多西他赛破坏了内皮细胞间的紧密连接56-59
• 5.4.2 多西他赛可影响内皮细胞功能59-60
• 5.5 小结与讨论60-63
• 6 总结和展望63-65
• 6.1 总结63-64
• 6.2 展望64-65
• 致谢65-67
• 参考文献67-73
• 附录73-75
• A. 作者攻读硕士期间发表的论文目录73
• B. 作者攻读硕士学位期间参与的科研项目73-75

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