人血中氨基酸及肉碱定量检测和多肽药物的质量控制

发布时间：2017-05-12 05:00

  本文关键词：人血中氨基酸及肉碱定量检测和多肽药物的质量控制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：遗传性代谢病是由于基因突变导致体内某种酶、运载蛋白、膜或受体的功能发生改变，使得机体生化代谢紊乱，造成中间或旁路代谢产物蓄积或终末代谢产物缺乏，出现一系列临床症状的一类疾病。患者如果没有及时诊断和治疗，将会损伤神经系统，影响智力，引起昏迷甚至死亡。因此，开展遗传性代谢病筛查是十分必要的。 液相色谱串联质谱的方法筛查遗传性代谢病能够对多个代谢产物多种疾病进行同时检测，具有灵敏度高、特异性强、分析速度快等特点，其假阳性率低、高通量的特性适合临床上大规模的应用。本实验拟通过利用液相色谱串联质谱建立人体血液中内源性代谢物氨基酸和酰基肉碱的定量检测方法，实现同时对氨基酸、有机酸、脂肪酸类代谢疾病的筛查，并研究不同年龄、地区是否对体内氨基酸和酰基肉碱的含量有影响。 本研究建立了人体血液中10种氨基酸和32种酰基肉碱类代谢物的检测方法。用含有内标的甲醇试剂提取干滤纸血片中的氨基酸和酰基肉碱，经盐酸正丁醇衍生化以后，利用液相色谱串联质谱进行分析。其中大部分α-氨基酸采用中性丢失的扫描模式，丢失基团质荷比为102.1Da；部分酰基肉碱采用母离子扫描的模式，子离子质荷比为85Da；其他氨基酸和酰基肉碱采用多反应监测的扫描模式。通过Masslynx软件计算血样中氨基酸和酰基肉碱的含量。 这个方法能够同时筛查13种氨基酸、13种有机酸以及11种脂肪酸类代谢疾病，当检测到某种代谢物含量明显超出或低于参考值范围时，提示该人可能患有这类疾病。在筛查的205例血样中没有发现代谢异常的患者。另外，我们还利用靶标代谢组学的方法，针对年龄和地域因素，对44种检测代谢物指标进行多元统计学分析。经偏最小二乘判别分析找出差异代谢物，并结合T-检验，发现不同年龄人群氨基酸和酰基肉碱含量不同。出生30天以上和30天内的人群相比，体内缬氨酸、瓜氨酸、游离肉碱含量明显升高，而甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、亮氨酸、乙酰肉碱、鸟氨酸的含量降低，结果呈现年龄相关性，提示当进行不同年龄人群遗传性代谢疾病筛查时应选择适宜的参考值范围。对于同一年龄段的高原同非高原人群，高原人群血液中甘氨酸和丙氨酸的含量较高，精氨酸的含量则相对较低，这可能同饮食生活习惯、高原缺氧等原因有关。这将可能为高原人群氨基酸的营养健康状况评价依据。 多肽类药物是一类重要的生物活性物质，具有易吸收、副作用小、生物活性强等特点，是药物研究中一个重要领域。由于多肽主要由氨基酸组成，相对分子量较大，容易降解，因此在质量控制方法有与一般的化学药物不同的方面，除了参考一般化学药物进行常规项目分析外，还应根据多肽的特点进行针对性研究。 艾塞那肽是一种人工合成的含有39个氨基酸的多肽类糖尿病治疗药物，为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，对Ⅱ型糖尿病患者的血糖控制有良好的效果，具有促进胰腺β细胞增殖和胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的释放以及减缓胃排空、抑制食物摄取的作用。是近年来首个在全球范围内获批的新型治疗Ⅱ型糖尿病的药物。 本研究拟通过对艾塞那肽的实验研究，达到对其生产使用过程的质量控制。根据中国药典和合成多肽药物药学研究技术指导原则，结合艾塞那肽合成工艺，参考有关文献，，对艾塞那肽的质量控制方法进行系统研究。通过对艾塞那肽分析的探索，建立多肽类药物质量控制的相关检测项目和方法，为多肽类药物质量标准的制定提供参考。 主要从纯度、分子量、氨基酸序列、氨基酸组成、肽图、等电点、红外光谱、紫外光谱、有关物质方面对艾塞那肽进行质量控制分析。利用高效液相色谱测定艾塞那肽纯度为99.63%。经基质辅助激光解吸附飞行时间质谱表明该化合物的相对分子量为4186.86Da，与理论计算分子量4186.60Da相比差2.6ppm。采用Edman降解和串联质谱的方法分别对艾塞那肽进行N端15个氨基酸分析和全序列分析，结果均与理论序列一致，证明不存在截短肽或修饰性肽链以及其它多肽。氨基酸组成分析的结果表明艾塞那肽氨基酸种类及组成含量与理论值相符，各种氨基酸摩尔百分含量的偏差小于1.5%。艾塞那肽的肽质量指纹图谱有4个特征肽段，各肽段分子量与理论值基本相同。等电点测定采用凝胶等电聚焦电泳和全柱成像毛细管等电聚焦电泳(Capillary Isoelectric Focusing-Whole Column ImagingDetection, CIEF-WCID)的方法，结果基本相同，但CIEF-WCID所需时间明显较短。艾塞那肽的紫外和红外光谱信息能够表明样品分子结构中含有共轭双键、氨基肽键、酚羟基、甲基、亚甲基、苯基等基团。 研究中首次运用CIEF-WCID方法建立了艾塞那肽有关物质的分析检测方法。首先利用串联质谱对艾塞那肽合成过程中可能产生的有关物质，即断裂肽3-39、N端乙酰化肽Ac-His、氧化肽Met14SO和断裂肽10-39进行全序列分析，确证其结构。然后考察CIEF-WCID方法的准确性和重复性，检测三种多肽的等电点相对误差不超过2%，日内和日间精密度分别小于0.12%和0.24%，表明该方法具有良好的准确性和重复性。最后使用CIEF-WCID的方法对艾塞那肽及其有关物质进行了分离分析，通过加入不同浓度和不同种类的增溶剂(尿素、甘油、蔗糖)、改变两性电解质范围、更换两性电解质品牌的方式改善艾塞那肽和有关物质的分离度，最终确定使用AES pH3-10和Sigma pH4-6的两性电解质对艾塞那肽样品进行有关物质检测。该结果提示CIEF-WCID的方法可以用做对多肽的分离测定和质量控制，为今后多肽和蛋白质的质量研究提供一种新的技术手段。
【关键词】：遗传性代谢病 靶标代谢组学 艾塞那肽 质量控制 全柱成像毛细管等电聚焦电泳
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R917
【目录】：

• 英文缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-19
• 第一部分 人血中氨基酸及肉碱定量检测19-33
• 1 实验材料19-20
• 1.1 试剂和材料19
• 1.2 同位素内标和浓度19-20
• 1.3 仪器20
• 2 实验方法20-23
• 2.1 样品采集20
• 2.2 工作液的配制20-21
• 2.3 样品前处理方法21
• 2.4 液相方法21
• 2.5 质谱方法21-22
• 2.6 方法精密度22
• 2.7 数据处理与统计学分析22-23
• 3 实验结果23-32
• 3.1 实验条件优化23-25
• 3.2 方法精密度25
• 3.3 检测代谢疾病种类25-27
• 3.4 检测结果27-29
• 3.5 结果分析29-32
• 4 小结32-33
• 第二部分 多肽药物的质量控制33-61
• 1 实验材料33-34
• 1.1 试剂和材料33-34
• 1.2 仪器34
• 2 实验方法34-38
• 2.1 纯度34
• 2.2 分子量34
• 2.3 氨基酸序列分析34-35
• 2.4 氨基酸组成分析35
• 2.5 肽质量指纹图谱35-36
• 2.6 等电点36
• 2.7 红外光谱36
• 2.8 紫外光谱36
• 2.9 有关物质36-38
• 3 实验结果38-58
• 3.1 纯度38-39
• 3.2 分子量39
• 3.3 氨基酸序列分析39-43
• 3.4 氨基酸组成分析43-44
• 3.5 肽质量指纹图谱44-45
• 3.6 等电点45-47
• 3.7 红外光谱47-48
• 3.8 紫外光谱48
• 3.9 有关物质48-58
• 4 小结58-61
• 结论61-62
• 参考文献62-67
• 综述：串联质谱法在新生儿遗传代谢病筛查中的应用67-75
• 参考文献72-75
• 论著：全柱成像毛细管等电聚焦电泳测定艾塞那肽等电点75-83
• 个人简历83-84
• 致谢84

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 艾婷;刘俐;;2010年西安地区高危婴幼儿中遗传代谢病筛查情况分析[J];中国儿童保健杂志;2012年03期

2 顾学范;叶军;韩连书;;上海地区遗传代谢病的新生儿筛查(英文)[J];临床儿科杂志;2009年02期

3 顾学范,周建德,叶军;上海地区新生儿先天性肾上腺皮质增生症的筛查[J];中华预防医学杂志;2002年01期

  本文关键词：人血中氨基酸及肉碱定量检测和多肽药物的质量控制，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：358779