多功能纳米抗体的构建及其抗肿瘤机制研究

发布时间：2017-05-15 01:13

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【摘要】：自从抗CD20抗体-利妥昔单抗1997年被FDA批准上市以来,已经超过数十种抗体被用来治疗肿瘤。尽管单克隆抗体在治疗肿瘤方面取得一定的疗效,但其效果温和。为了提高抗体的治疗效果,研究者们将抗体与化疗药物、毒素、免疫因子、放射性核素等制备成复合物,或者通过融合蛋白技术制备成多功能抗体。但是这些抗体剂型仍然存在着一些不足,如细胞毒性更高,瘤内富集程度较低,机制不明,容易产生耐药等问题。近年来,纳米医药由于具有EPR效应能够显著增强药物的瘤内富集而成为抗肿瘤的研究热点。目前基于纳米技术的靶向治疗主要集中在抗体介导的靶向体系。而围绕抗体结构组成本身,利用纳米技术,构建新型纳米尺度的抗体(nano antibody,nAb)研究却很少。本课题组前期通过纳米技术将I和II型两种抗CD20抗体偶联制备纳米抗体团簇,结果发现,其相比于游离的抗体而言,抗体团簇诱导凋亡的能力大大增强。我们认为该额外凋亡的增加来源于胞外抗原交联。基于此,我们猜想:进一步交联或者受限靶细胞上CD20分子能否促进细胞凋亡的增强?在本课题中,我们通过化学合成将I型抗CD20抗体连接不同链长高分子上(PEIn-R,n=1.8,10,25,50,750 kDa),实现不同程度的抗原交联;同时,将抗体偶联到一个具有温敏功能的高分子长链(PI-4-R),该温敏高分子poly(N-isopropylacrylamide)(PNIPAM)具有最低临界溶解温度(Lower critical solution temperature,LCST),其链随着温度的升高而收缩,可以实现抗原的进一步受限。动静态散射仪(Dynamic/static laser light scattering,DLLS/SLLS),透射电子显微镜(TEM)及SDS-PAGE蛋白电泳胶等手段均证实不同链长PEI-R及PI-4-R成功合成,具有明显的类似梳状的结构。且相比单独的PI-4载体,接上抗体之后的PI-4-R的LCST提高了接近2℃,这主要是因为PI-4链上接上大量亲水性抗体之后,与水分子间的作用力增强,所以相转变温度出现相应的提高,这也从间接说明PI-4成功与CD20抗体连接。每个纳米抗体链上偶联的抗体数目在SLLS上得到进一步的计算,PEI750000-R及PI-4-R上的抗体数目分别为250和300。纳米抗体与抗原的结合、解离能力检测结果表明,与母代游离的Rituximab相比,不同类型的纳米抗体与Raji细胞表面CD20分子的结合能力相似,但是其解离率却大大下降,说明纳米抗体构建成功,暗示其与肿瘤细胞的相互作用更强。随后,我们分别采用人血清和人外周血淋巴细胞来进行补体依赖的细胞毒性作用(Complement-dependent cytotoxicity,CDC)和抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(Antibody-dependent cellular cytotoxicity,ADCC)研究,结果发现我们所制备的六种纳米抗体具有与Rituximab类似的CDC和ADCC效应,说明我们对抗体的改造并未改变母代抗体的结构和功能。然而,我们利用流式细胞仪对纳米抗体诱导肿瘤细胞程序性细胞死亡(Programmed cell death,PCD)进行筛选后发现,相对于Rituximab,纳米抗体获得了很高的类似于II型抗CD20抗体所具有的PCD功能。而且,该PCD效应随着链长的增加(也就是抗原交联程度增加)而明显增强;同时,在相同抗原交联情况下,随着温度的升高(抗原受限程度增加),纳米抗体诱导的PCD进一步增加。随后,我们通过流式细胞仪、共聚焦显微镜等技术对纳米抗体诱导PCD的机制进一步探讨,结果显示,当进一步增加抗原交联或抗原受限后,纳米抗体诱发靶细胞内溶酶体破裂或弥散程度增强,释放出溶酶体内容物组织蛋白酶B增多;而组织蛋白酶B作用于线粒体上的相关蛋白,导致线粒体通透性增加,释放出细胞色素C,进而激活下游的Casepase凋亡通路诱导细胞死亡。该溶酶体依赖性的凋亡功能在蛋白质印迹中得到进一步证实。之后,我们通过皮下荷瘤小鼠(SCID鼠)和原位血液^

本文编号：366610