miR-218调控小鼠胚胎干细胞体外定向分化心肌细胞研究

发布时间：2017-05-15 13:00

  本文关键词：miR-218调控小鼠胚胎干细胞体外定向分化心肌细胞研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：microRNAs (miRNAs)是存在于真核生物中具有调控功能的内源性非编码RNA,大小通常为19-25个长度的核苷酸。研究表明,miRNA通过碱基互补配对原理调控靶基因mRNA表达,参与调节细胞增殖、凋亡、迁移、脂肪代谢及胚胎器官形成等多种生理功能。miR-218 (miRNA-218)是一种首先被发现在中枢神经系统中有高表达的miRNA,目前关于miR-218的研究主要集中在恶性胶质细胞瘤,miR-218可以通过调节不同靶基因参与调控胶质瘤细胞的侵袭、迁移、增殖及肿瘤干细胞的全能性,这已成为恶性胶质细胞瘤临床研究的一个热点。而在心脏发育领域,近几年仅有少量关于miR-218相关研究报道。在斑马鱼胚胎发育过程中,miR-218可以通过与Tbx5之间互相调控而影响心脏发育,miR-218表达被抑制后可以抵消部分由于TBX5过表达后引起的心脏循环发育阻滞。过表达miR-218后可引起斑马鱼胚胎心脏发育畸形、心房发育不全、心室间隔无法正常形成等现象。但miR-218可能调控的靶基因及参与心肌细胞分化的作用机制尚未完全阐明。并且斑马鱼细胞中miR-218分型与哺乳动物细胞中miR-218分型不同,斑马鱼细胞中miR-218不同亚型参与心脏发育不同过程的调控。因此,亟待在哺乳动物胚胎发育代表性强的体系中加以研究。小鼠胚胎干(embryonic stem, ES)细胞自首次从小鼠胚囊内层细胞中发现后,因可以在体外适宜条件下无限制增殖并具有分化成所有体细胞的全能性而在各种研究中得到广泛应用。已有报道miR-1和miR-133参与调控胚胎心肌分化发育及心血管的形成,Let-7家族也可参与调控心血管疾病的发生及ES细胞定向心肌分化过程。miR-218参与调控ES细胞全能性的维持。另在口腔鳞状细胞癌中miR-218通过靶基因Rictor参与调控肿瘤的发生和迁移。而干细胞与肿瘤细胞之间存在着惊人的相似性,因此,影响肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移等功能的某些信号调控网络,在控制干细胞功能中同样发挥着重要作用。ES细胞体外定向心肌细胞分化过程伴随着细胞迁移运动,拟胚体(embryonid bodies, EBs)的形成过程模拟了ES细胞体内形成三胚层原肠胚的过程,其中涉及包括细胞的分裂增殖,迁移,聚集和重排在内的一系列形态发生运动。有文献表明,miR-124参与EBs形成过程中细胞迁移的调控,miR-124表达上调后抑制EB铺展以及ES细胞迁移,并抑制ES细胞分化。miR-218可以通过靶基因Robol调控Slit/Robol信号通路,并调节迁移相关蛋白Cdc42和黏附相关蛋白Rac1的表达,影响恶性胶质细胞瘤细胞的迁移。但迄今尚未见有关miR-218对ES细胞定向分化心肌细胞及分化中伴随的细胞迁移作用报道。因此,本研究主要利用小鼠ES细胞体外定向分化为心肌细胞模型,探索miR-218在ES细胞定向心肌细胞分化过程中的调控作用,并进一步采用生物信息学方法,通过miRNA靶基因数据库如Targetscan、miRanda、Pictar等,对特定miRNA可能的靶基因进行序列分析及预测,并采用miRNA分析数据库如miRPath. Tarbase和MicroT-CDS等对靶基因进行功能分类,并利用PCR法对预测结果进行基因表达水平的鉴定。旨在阐明miR-218表达调控与ES细胞分化为心肌细胞间的关系,揭示miR-218潜在可能参与调控心肌分化过程的靶基因,为深入研究miR-218在ES细胞分化中的作用机制提供实验依据。目的：探索miR-218对小鼠ES细胞定向分化心肌细胞的调控作用及miR-218潜在可能参与调控心肌细胞分化的靶基因。阐明miR-218表达调控与ES细胞分化为心肌细胞间的相关性,揭示ES细胞分化过程中miR-218转录后调控分子信息。实验方法：采用经典的“悬滴培养-悬浮培养-贴壁培养”三步法ES细胞定向心肌细胞分化模型,利用miR-218拟似物(miR-218 mimic)和miR-218抑制剂(miR-218 inhibitor)分别转染小鼠ES细胞,检测搏动心肌细胞团分化率变化,并运用免疫印迹技术、流式细胞术和免疫荧光染色法检测小鼠ES细胞中miR-218的表达调控与心肌细胞定向分化过程中心肌特异性转录因子及心肌细胞特异性蛋白水平的表达,心肌细胞数量,钙离子通道相关蛋白表达变化及心肌肌小节成熟结构的形成情况。采用活细胞工作站测定分化来的心肌细胞内质网Ca2+瞬变。通过生物信息学分析ES细胞中可能与miR-218互补结合的靶基因序列,并运用RT-PCR及qRT-PCR检测miR-218 mimic对部分预测出可能靶基因的表达水平影响。根据预测结果,进而利用划痕法和Transwell法检测miR-218对ES细胞体外分化中伴随的迁移现象的调控作用,并用免疫印迹技术探究miR-218对ES细胞定向心肌分化过程中细胞迁移相关蛋白的影响。实验结果：1. miR-218 mimic转染小鼠ES细胞后,抑制心肌细胞分化,在day 5+2和day 5+3时心肌细胞分化率分别为12±3%和32±7%,较阴性对照组29±4%和56±5%显著减少(P0.01)。中胚层特异性标记蛋白brachyury,心肌特异性转录因子Nkx2.5、GATA4、TBX5,肌小节结构蛋白a-Actinin,窦房结样心肌细胞特异性蛋白HCN4,心房样心肌细胞特异性蛋白ANP及心室样心肌细胞特异性蛋白MLC-2v,桥粒蛋白Desmoplakin,间隙连接蛋白Cx43和钙相关蛋白N-cadherin的表达均呈现显著性下降。同时,miR-218 mimic显著降低day 5+3心肌细胞内咖啡因刺激后Ca2+瞬变幅度。流式细胞术检测结果显示,ES细胞转染miR-218 mimic后分化成心肌细胞数量减少。并且,免疫荧光结果显示miR-218 mimic组分化而来的心肌细胞肌小节结构紊乱。而miR-218 inhibitor转染ES细胞后,能促进心肌细胞分化时相提前。在day 5+1时就出现搏动心肌细胞团,分化率为4±3%。在day 5+2和day 5+3时心肌细胞分化率分别为68±4%和84±8%,较阴性对照组29±5%和56±7%显著增加(P0.01)。miR-218 inhibitor促进中胚层特异性标记蛋白brachyury的表达,Nkx2.5、GATA4、TBX5、α-Actinin、HCN4、ANP、MLC-2v、L-type Ca2+ CPα1D、 CaMKIIδ、Desmoplakin、Cx43和N-cadherin蛋白表达水平均上调。miR-218 inhibitor增加α-Actinin阳性表达的心肌细胞数,且促进分化而来的细胞肌小节结构清晰完整,显著提高day 5+3心肌细胞内Ca2+瞬变幅度。2.生物信息学方法预测分析出164个miR-218的可能靶基因,经miRNA功能分析数据库miRPath发现miR-218参与调控20条信号通路。结合预测结果及文献报道,选择了其中四条与心肌分化相关的信号通路中部分靶基因进行基因水平的验证,具体包括磷脂酰肌醇信号系统(Phosphatidylinositol signaling system),谷氨酸的突触调控通路(Glutamatergic synapse),细胞间连接(Gap junction)和mTOR信号调控系统中的Rictor、Pik3r1、Pi4k2a、Adcy1、Shank2、Pdgfr-α、Grml 和 Gnai2。PCR结果显示,miR-218 mimic可以显著下调Rictor、Pik3r1、Shank2、 Pdgfr-α、Grm1基因水平的表达。3.基于miR-218靶基因预测并验证出的靶基因Pdgfr-α、Grml和Rictor,结合文献报道,其可以参与心肌分化发育调控,并调控肿瘤细胞迁移,同时细胞迁移在小鼠ES细胞定向心肌分化发育过程中也发挥着重要的作用,本实验对miR-218表达与小鼠ES细胞心肌分化中的迁移能力调控进行了进一步的探究。在小鼠ES细胞定向心肌细胞分化过程中,miR-218 mimic组EBs铺展迁移最远细胞距EBs边缘的平均距离为431.1μm,显著大于对照组EBs细胞迁移平均距离350.1μm, miR-218表达上调促进EBs细胞迁移,miR-218 inhibitor组EBs细胞迁移距离为235.9μm,显著小于对照组迁移距离318.7μm。体外划痕实验结果显示,miR-218 mimic转染后ES细胞迁移距离在12 h和24 h较阴性对照组都有显著增加,划痕愈合面积比增大。Transwell实验结果显示,miR-218 mimic组平均每个视野迁移的ES细胞数目为180个,较阴性对照组的120个显著增加,提示miR-218mimic具有促进小鼠ES细胞体外迁移作用。该作用可能与miR-218通过下调靶基因Grm1,Pdgfr-α及Rictor的表达,进而抑制细胞迁移相关蛋白Rac1和Cdc42表达有关。结论：1.在小鼠ES细胞体外定向分化为心肌细胞过程中,miR-218表达量与心肌分化密切相关,miR-218 mimic可抑制ES细胞定向中胚层分化,抑制心肌细胞分化。而miR-218 inhibitor的作用则相反。2.通过生物信息学方法预测发现miR-218可能参与细胞内20条信号通路的164个基因的表达调控。其中与心肌分化相关的4条信号通路中,miR-218 mimic可以显著下调Rictor、Pik3r1、shank2、Pdgfr-α、Grm1基因水平的表达,可作为miR-218调控ES细胞定向分化心肌细胞作用机制的重要靶点进行深入研究。3.miR-218表达量与ES细胞定向心肌分化过程中EB细胞的铺展能力相关,miR-218 mimic可以促进ES细胞的体外迁移能力,miR-218 inhibitor的作用则相反。miR-218参与ES细胞迁移的调控作用可能与调节靶基因Grml、Pdgfr-α和Rictor表达,影响细胞迁移相关蛋白Racl和Cdc42表达有关。
【关键词】：miR-218 ES细胞 心肌细胞 定向分化 迁移
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【目录】：

• 致谢5-6
• 中文摘要6-11
• Abstract11-17
• 论文创新点17-18
• 缩略词表18-21
• 引言21-25
• 实验仪器和材料25-28
• 1 动物、细胞株25
• 2 仪器25
• 3 仪器及耗材25-26
• 4 溶液的配制26-28
• 实验方法28-36
• 1 细胞培养28-29
• 1.1 原代小鼠胚胎成纤维细胞制备28
• 1.2 饲养层的制备28
• 1.3 小鼠ES细胞的支持培养28-29
• 2 miRNA转染ES细胞及分化培养29
• 2.1 miR-218 mimic/inhibitor转染29
• 2.2 悬滴培养29
• 2.3 悬浮培养29
• 2.4 贴壁培养29
• 3 Western blotting检测蛋白表达29-30
• 3.1 总蛋白提取30
• 3.2 蛋白印迹实验30
• 4 实时定量PCR30-31
• 5 RT-PCR基因表达检测31-32
• 6 免疫荧光染色法检测心肌特异性蛋白α-Actinin的表达32-33
• 7 流式细胞术定量检测miR-218 mimic/inhibitor对心肌特异性蛋白表达的影响33
• 8 ES细胞分化为心肌细胞内钙瞬变测定33-34
• 8.1 试剂配制33
• 8.2 钙瞬变检测33-34
• 9 细胞迁移34
• 9.1 EBs中细胞迁移34
• 9.2 细胞划痕实验检测miR-218 mimic/inhibitor对ES细胞迁移能力的影响34
• 9.3 Transwell细胞迁移实验34
• 10 靶基因预测及通路分析34-35
• 11 数据分析35-36
• 第一部分 miR-218表达调控对小鼠ES细胞定向分化为心肌细胞的影响36-48
• 1 实验结果36-46
• 1.1 miR-218 mimic/inhibitor对小鼠ES细胞定向心肌细胞分化率的影响36-37
• 1.2 miR-218 mimic/inhibitor对小鼠ES细胞分化为心肌细胞肌小节结构的影响37-38
• 1.3 miR-218 mimic/inhibitor对小鼠ES细胞分化为心肌细胞数量的影响38-39
• 1.4 miR-218 mimic/inhibitor对小鼠ES细胞衍生心肌细胞钙瞬变的影响39-40
• 1.5 miR-218 mimic/inhibitor对小鼠ES细胞分化为EBs时中胚层形成的影响40-41
• 1.6 miR-218 mimic/inhibitor对小鼠ES细胞定向分化为心肌细胞中早期心肌特异性转录因子蛋白及基因表达的影响41-42
• 1.7 miR-218 mimic/inhibitor对小鼠ES细胞定向分化为心肌细胞中心肌特异性蛋白表达的影响42-44
• 1.8 miR-218 mimic/inhibitor对小鼠ES细胞体外定向分化的心肌细胞中心肌功能调控相关蛋白表达的影响44-46
• 2 讨论46-47
• 3 小结47-48
• 第二部分 miR-218在小鼠ES细胞定向心肌分化过程中对靶向基因调控作用研究48-63
• 1 实验结果48-59
• 1.1 miR-218靶基因预测和通路分析48-53
• 1.2 miR-218 mimic/inhibitor在小鼠ES细胞体外定向心肌分化过程中对Rictor、Pik3r1、Pi4k2a、Adcy1、Shank2、Pdgfr-α、Grml和Gnai2基因水平表达的影响53-54
• 1.3 miR-218 mimic/inhibitor对小鼠EBs细胞体外迁移的影响54-55
• 1.4 miR-218 mimic/inhibitor对ES细胞体外迁移的影响55-58
• 1.5 miR-218 mimic/inhibitor对小鼠ES细胞迁移相关蛋白表达的影响58-59
• 2 讨论59-62
• 3 小结62-63
• 总结63-64
• 参考文献64-74
• 综述 miRNA调控胚胎干细胞自我更新及分化的研究进展74-86
• 参考文献78-86
• 作者简历及在读期间所取得研究成果86-87

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