MiR-181c对耐顺铂鼻咽癌细胞凋亡的作用及其机制

发布时间：2017-05-23 20:09

  本文关键词：MiR-181c对耐顺铂鼻咽癌细胞凋亡的作用及其机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:1.验证耐药鼻咽癌细胞HNE1/DDP的耐药性。2.检测鼻咽癌细胞HNE1/DDP和HNE1中mi R-181c表达的差异并且研究其对细胞凋亡的作用。3.探讨mi RNA影响鼻咽癌细胞凋亡的机制。方法:1.MTT法检测不同浓度顺铂(DDP)对两株细胞HNE1和HNE1/DDP的增殖抑制的影响;根据24、48、72h的IC50值确定耐药株细胞的耐药指数;鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP中抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2和促凋亡蛋白Bax和Bim的蛋白表达水平则采用Western blot实验方法检测,进一步验证耐药株细胞的耐药性。2.根据课题组之前的Micro RNA(mi RNA)芯片结果筛选出差异表达的mi R-181c,并采用荧光定量RT-PCR方法验证表达的差异。3.分别将类似物mi R-181c mimics、抑制剂mi R-181c inhibitors转染到表达量低的HNE1/DDP和表达量较高的HNE1细胞株中,RT-PCR方法检测转染后mi R-181c在两株细胞中的表达情况;MTT法检测转染mi R-181c mimics和inhibitors后对两株细胞增殖抑制的影响;集落克隆、PI单染以及Annexin V/PI双染法检测两株细胞凋亡的变化。4.采用Western blot方法检测mi R-181c的调控对Mcl-1基因在两株细胞中的表达的影响;转染Mcl-1 si RNA,集落克隆和Annexin V/PI双染法检测凋亡的变化。结果:1.鼻咽癌细胞HNE1/DDP相对亲本细胞HNE1具有耐药的特性(1)MTT法显示:在24、48、72h,不同浓度的DDP(2、4、8、16、32μmol·L-1)作用于鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP能够抑制其增殖,且呈时间和浓度依赖性。在24、48、72h,鼻咽癌细胞HNE1/DDP的半数抑制率(IC50)计算后得出分别为32.15±0.37、21.88±0.49、14.76±0.56μmol·L-1,鼻咽癌细胞HNE1的IC50为7.87±0.33、5.25±0.15、3.45±0.35μmol·L-1。鼻咽癌细胞HNE1/DDP耐药指数(RI)计算后得出为4.08、4.16、4.27。从计算得出的IC50以及RI可以看出,耐药株细胞HNE1/DDP是符合耐药株的条件的,耐药株的耐药性得以验证。(2)Western blot和荧光定量PCR结果同时显示:在耐药株HNE1/DDP细胞中,抗凋亡蛋白以及抗凋亡基因MRP、Bcl-2表达升高,促凋亡蛋白和促凋亡基因Bax、Bim表达下降。2.mi R-181c在HNE1和HNE1/DDP中的表达具有差异课题组前期的mi RNA芯片结果显示,mi R-181c在两株细胞中的表达具有差异,我们采用荧光定量RT-PCR验证结果显示,在HNE1中,mi R-181c具有3.5倍的上调。3.mi R-181c的调控对鼻咽癌细胞凋亡的影响(1)在低表达mi R-181c的HNE1/DDP细胞中,转染mi R-181c的模拟物使其表达增加,相反地,在高表达mi R-181c的HNE1细胞中,转染mi R-181c抑制剂使其表达减少。转染之后,采用荧光定量RT-PCR再次检测两株细胞中的表达情况,结果证明,mi R-181c类似物可以使细胞中mi R-181c的表达增加,而mi R-181c抑制剂则降低mi R-181c的表达。(2)MTT结果显示,mi R-181c抑制剂能明显增强HNE1细胞耐顺铂能力,mi R-181c模拟物降低HNE1/DDP细胞对顺铂的耐受力。此外,集落克隆、PI单染以及Annexin V/PI双染法结果均显示,mi R-181c抑制剂能明显降低顺铂作用HNE1细胞的凋亡率,mi R-181c模拟物增加了顺铂作用于HNE1/DDP细胞的凋亡率。4.mi R-181c通过作用于Mcl-1对鼻咽癌细胞的凋亡产生影响(1)Western blot结果显示,HNE1/DDP细胞中Mcl-1的表达明显高于HNE1细胞。(2)Western blot结果显示,mi R-181c抑制剂能使HNE1细胞中Mcl-1增加,mi R-181c模拟物能使HNE1/DDP细胞中Mcl-1降低。(3)将Mcl-1 si RNA、阴性对照si RNA转染进鼻咽癌细胞HNE1/DDP中,western blot和q RT-PCR检测Mcl-1表达减少,证明成功干扰了Mcl-1的表达。集落克隆结果可以看出,干扰了Mcl-1的表达后能减少HNE1/DDP细胞集落的形成。此外,PI单染和Annexin V/PI双染法结果表明,干扰Mcl-1的表达后能增加顺铂诱导的HNE1/DDP细胞的凋亡率。结论:1.HNE1/DDP较亲本细胞HNE1具有耐药的特性。2.HNE1和HNE1/DDP细胞中mi R-181c的表达是不同的,降低mi R-181c的表达以后可以降低HNE1细胞由顺铂诱导的凋亡。相反,过表达的mi R-181c能够增加HNE1/DDP细胞的凋亡。3.Mcl-1的表达受mi R-181c的调控,降低mi R-181c的表达,Mcl-1表达升高,相反地,增加mi R-181c的表达,Mcl-1的表达下降;Mi R-181c基因过表达增加顺铂诱导的HNE1/DDP细胞的凋亡。
【关键词】：鼻咽癌 耐药 microRNA siRNA 细胞凋亡
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 引言11-15
• 材料与方法15-28
• 1. 仪器与材料15
• 1.1 实验仪器15
• 1.2 试剂15
• 1.3 细胞系15
• 2.实验方法15-27
• 2.1 细胞培养15-17
• 2.2 MTT法检测细胞存活率17
• 2.3 细胞转染17-18
• 2.4 溴化吡啶 (propiodide, PI) 染色检测细胞凋亡18-19
• 2.5 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡19
• 2.6 集落克隆实验19
• 2.7 荧光定量RT-PCR检测mRNA表达19-22
• 2.8 荧光定量RT-PCR检测miRNA的含量22-24
• 2.9 免疫印迹法（western blot）检测蛋白的表达24-27
• 3. 统计学处理27-28
• 结果28-38
• 1.鼻咽癌耐药株细胞HNE1/DDP具有耐药特性28-30
• 2. miR-181c在HNE1和HNE1/DDP中的表达具有差异30
• 3.调控两株细胞HNE1和HNE1/DDP中miR-181c的表达及其调控对细胞凋亡的影响30-35
• 4. miR-181c通过介导Mcl-1 对鼻咽癌细胞凋亡的调控作用35-38
• 讨论38-42
• 结论42-43
• 参考文献43-50
• 致谢50-51
• 附录A 英中文术语缩略语表51-52
• 附录B 常用试剂配制方法52-55
• 附录C 个人简历及发表论文55-56
• 附录D 综述56-67
• 参考文献62-67

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本文编号：388986