磷脂爬行酶1抑制HBV复制的分子机制研究

发布时间：2017-06-05 19:17

  本文关键词：磷脂爬行酶1抑制HBV复制的分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是我国最重大的传染病之一,HBV感染不仅可以引起急、慢性肝炎,还可导致肝炎、肝硬化和肝癌,在我国约有1.2亿HBV携带者,其中2000多万人为慢性乙肝患者。HBV感染和相关疾病严重影响患者的健康,同时也给患者家庭和社会带来巨大的经济负担。现在对HBV感染致病机理仍不是很清楚,也没有对HBV感染特别有效的药物。目前临床上广泛使用的抗HBV药物包括干扰素(interferon,IFN)和核苷类似物,但使用干扰素副作用较大,而核苷类似物停药后容易复发,且易发生耐药。继续研制和开发高效低毒的抗乙型肝炎病毒药物仍然是当务之急。磷脂爬行酶1(phospholipid scramblase1,PLSCRl)属于钙离子结合的、棕榈酰化的II型膜蛋白。研究显示,非棕榈酰化的PLSCR1也能进入细胞核内并与基因组DNA结合。同时PLSCR1也是干扰素刺激基因,干扰素可以通过蛋白激酶C依次激活JNK和STAT1信号通路,继而调控PLSCR1的表达。据文献报道,通过PLSCR1特异性小干扰抑制PLSCRl表达后,IFN抑制水泡性口炎病毒和脑心肌炎病毒的活性明显下降,所以上调PLSCRl表达有可能通过增加抗病毒基因的表达来增强IFN的抗病毒活性。我们前期通过免疫共沉淀等实验发现,PLSCR1与HBV表面蛋白PreS1结构域有相互作用,进一步研究表明在体内外高表达PLSCR1均可以显著抑制HBV复制,但是其作用机制尚不明确,基于这些研究结果,本课题继续研究PLSCR1与HBV复制的关系,为进一步研究HBV与宿主相互作用奠定基础,为临床HBV治疗提供新的思路。目的:探讨人磷脂爬行酶1抑制HBV复制的分子机制。方法:将PLSCR1质粒与HBV1.3质粒共同转染HepG2细胞后,提取细胞内和培养基中HBV-DNA,通过荧光定量PCR检测PLSCR1与HBV1.3质粒不同比例转染后对HBV复制的抑制情况;设计合成PLSCR1特异性siRNA,通过半定量PCR和Western blot等方法验证siRNA对PLSCR1在mRNA水平和蛋白水平的抑制作用;将经过干扰素处理的HepG2细胞转染HBV1.3质粒和PLSCR1特异性siRNA,提取细胞总RNA,逆转录后通过半定量PCR检测细胞中PLSCR1 mRNA表达水平变化,通过ELISA检测细胞培养液中HbsAg、HbeAg表达量的变化;在HepG2细胞中分别转染PLSCR1质粒、PLSCR1 siRNA、HBV1.3质粒48h后采用CCK-8检测各组细胞增殖变化情况,通过流式细胞仪检测各组细胞周期变化情况;将带有荧光素酶报告基因和HBV启动子基因的质粒与PLSCR1质粒共同转染HepG2细胞和Huh7细胞,48h后收取细胞上清,检测Gluc的活性,研究PLSCR1对HBV启动子的影响;将HepG2细胞分为空白对照组、PCMV-HA组、HBV1.3组与HBV1.3+PLSCR1组、PLSCR1组,各组转染对应的质粒,48h提取细胞总RNA,通过半定量PCR检测与HBV感染相关的多个基因的mRNA表达水平的变化;将HepG2细胞分为空白对照组、PCMV-HA组、HBV1.3组与HBV1.3+PLSCR1组、PLSCR1组,各组转染对应的质粒,48h提取细胞总蛋白,通过Western blot检测Toll样受体及其信号通路相关蛋白的表达变化情况。结果:在HepG2内高表达PLSCR1可以抑制HBV的复制;经过IFN处理的HBV阳性细胞,采用PLSCR1的siRNA抑制PLSCR1的表达,降低了IFN抑制HBV的作用,而且对细胞功能无显著影响;通过基因重组技术构建的含有HBV启动子基因的萤光素酶报告基因表达载体与PLSCR1共同转染HepG2细胞结果显示PLSCR1可以抑制HBV启动子的表达,HepG2细胞中,PLSCR1可以逆转多个HBV复制引起的细胞因子的变化;HBV1.3转染HpeG2细胞后抑制了TLR9蛋白的表达,PLSCR1质粒与HBV1.3质粒共同转染后TLR9蛋白表达量恢复正常。结论:PLSCR1在HepG2细胞中高表达可以抑制HBV复制;IFN通过PLSCR1发挥抗HBV作用;抑制或过表达PLSCR1对细胞功能没有明显影响;PLSCR1蛋白在HepG2细胞中定主要分布于细胞核周围的胞质中;PLSCR1通过抑制HBV启动子的表达而抑制HBV的复制;PLSCR1通过与多种基因相互作用发挥抗HBV作用;PLSCR1可以促进TLR9等免疫相关蛋白表达,进而增强细胞识别并抑制HBV的能力。
【关键词】：磷脂爬行酶1 乙型肝炎病毒 抗病毒
【学位授予单位】：河南中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 英文缩写字中英文全称对照表4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 实验一 抑制PLSCR1对HBV复制的影响14-31
• 实验材料14-17
• 实验方法17-24
• 实验结果24-31
• 实验二 PLSCR1对细胞功能的影响31-35
• 实验材料31
• 实验方法31-33
• 实验结果33-35
• 实验三 PLSCR1通过PPARA影响HBV的复制35-40
• 实验材料35
• 实验方法35-37
• 实验结果37-40
• 实验四 PLSCR1通过TLR9影响HBV的复制40-43
• 实验材料40
• 实验方法40-42
• 实验结果42-43
• 讨论43-47
• 结论47-48
• 致谢48-49
• 参考文献49-54
• 附录54-61
• 附录1 引物序列54-55
• 附录2 综述55-61
• 参考文献58-61
• 附录3 在校期间论文论著和科研情况61

【参考文献】

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1 傅磊，吴雪，孔玉英，，汪垣;乙肝病毒增强子对其基因表达的调控[J];生物化学与生物物理学报;1996年06期

  本文关键词：磷脂爬行酶1抑制HBV复制的分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：424457