抗新生血管生成肽ES-2的壳寡糖化修饰及其抗新生血管生成活性研究

发布时间：2017-06-09 06:03

  本文关键词：抗新生血管生成肽ES-2的壳寡糖化修饰及其抗新生血管生成活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：内皮抑素(Endostatin,ES)是从一种从小鼠内皮细胞瘤上清中分离纯化获得的内源性新生血管生成抑制剂,可通过抑制肿瘤组织新生血管的生成,实现对肿瘤营养供给途径和废物代谢途径的切断,从而起到抗肿瘤的作用。ES结构中有一短肽段(IVRRADRAAVP,ES-2)同样具有明显的抗新生血管生成活性,且更容易通过固相合成的方式获得。但ES-2也存在体内半衰期较短和稳定性差等缺点,其应用受到了很大的限制。研究表明,通过化学修饰的手段有望改善其这些缺点。壳寡糖具有一定的抗肿瘤生长和转移活性、具一定靶向性且结构明确,季铵化后的壳寡糖水溶性及带正电荷的能力更佳。故本课题采用6-O-季铵化壳寡糖(6-O-2′-hydroxylpropyltrimethyl ammonium chloride chitosan oligosaccharide,O-HTCCOS)对ES-2的末端羧基进行了化学修饰,获得了6-O-季铵化壳寡糖-ES-2修饰物(O-HTCCOS-ES-2),经研究发现,该结合物既保留了较高的抗新生血管生成活性,又整合了壳寡糖的良好特性,使其具有稳定性高、靶向性强和细胞亲和性强等特性。本课题研究内容和取得的主要成果如下:1.6-O-季铵化壳寡糖(O-HTCCOS)的合成与表征经过三步化学反应在壳寡糖C6位的羟基上引入季铵盐侧链,后经透析并冷冻干燥得到水溶性更好的季铵化壳寡糖,产率为95.26%。通过IR和1H NMR分析表征,O-HTCCOS结构与预期结构相符。茚三酮比色法测定6-O-季铵化壳寡糖的自由氨基率为87.35%。2.6-O季铵化壳寡糖-ES-2肽修饰物(O-HTCCOS-ES-2)的合成与表征以EDC/NHS作为交联剂,通过两步反应由ES-2肽分子上的羧基与O-HTCCOS分子的氨基通过酰胺键结合实现对ES-2的末端羧基的结构修饰,修饰率超过50%。采用SephadexG-25凝胶层析柱进行分离纯化,最终获得了O-HTCCOS-ES-2纯品。通过MALDI-TOF-MS质谱分析鉴定表明ES-2通过-CO-NH-被O-HTCCOS修饰,且ES-2与O-HTCCOS连接比例为1:1,即一分子ES-2被一分子O-HTCCOS修饰。3.O-HTCCOS-ES-2的热稳定性研究分别研究了O-HTCCOS-ES-2、ES-2在25℃和37℃环境中放置相同时间后对内皮细胞抑制能力的变化情况,从而比较二者的稳定性,结果表明,O-HTCCOS-ES-2的热稳定性优于ES-2。4.O-HTCCOS-ES-2的细胞亲和性研究流式细胞术研究结果表明,与ES-2相比,O-HTCCOS-ES-2对内皮细胞的亲和性更强,更加易于进入细胞发挥作用。5.O-HTCCOS-ES-2的体内外生物活性研究5.1 O-HTCCOS-ES-2的抗内皮细胞增殖作用研究(1)CCK-8法检测抗细胞增殖实验结果表明,不同浓度梯度的O-HTCCOS-ES-2、ES-2以及两者混合物在作用48 h后,均可显著抑制内皮细胞增殖,其中O-HTCCOS-ES-2作用效果明显优于ES-2或O-HTCCOS与ES-2混合物。且该抑制作用呈现出一定的药物浓度依赖性。(2)管腔形成实验测定体外抗新生血管生成活性结果表明,不同浓度梯度的O-HTCCOS-ES-2、ES-2以及O-HTCCOS和ES-2混合物分别作用6 h后,O-HTCCOS-ES-2修饰物的抗新生血管生成作用效果明显比ES-2以及两者混合物要强很多,且抗新生血管作用效果具有药物浓度依赖性。5.2 O-HTCCOS-ES-2的体内抗新生血管生成活性研究(1)鸡胚绒毛尿囊膜实验结果表明,O-HTCCOS-ES-2、ES-2以及O-HTCCOS和ES-2的混合物三种药物对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成均有一定的抑制作用,血管数量和其分支都有一定的减少,但O-HTCCOS-ES-2的抗新生血管生成作用效果优于ES-2以及混合物,且体内抗新生血管生成作用效果随着药物浓度的增大而加强。(2)斑马鱼模型体节血管生成实验结果表明,O-HTCCOS-ES-2,ES-2以及两者混合物均可抑制斑马鱼体节间新生血管的生成,且其中O-HTCCOS-ES-2的抗新生血管生成作用为最佳。5.3 O-HTCCOS-ES-2的抗细胞迁移作用研究划痕实验和Transwell小室法测定抗细胞迁移的抑制作用的两项实验结果均表明,O-HTCCOS-ES-2、ES-2以及两者混合物均可抑制内皮细胞的迁移,其中O-HTCCOS-ES-2表现出了最佳活性,且抑制迁移的作用呈现出药物浓度依赖性。
【关键词】：内皮抑素 ES-2 6-O季铵化壳寡糖 新生血管抑制作用
【学位授予单位】：曲阜师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96;R943
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 符号说明8-11
• 第1章 前言11-15
• 1.1 内皮抑素概述11-12
• 1.1.1 ES的来源和结构11
• 1.1.2 ES的生物活性11
• 1.1.3 ES的抗新生血管生成和抗肿瘤机制11-12
• 1.2 ES-2 肽概述12-13
• 1.2.1 ES-2 的生物活性12-13
• 1.2.2 ES-2 的作用机制13
• 1.3 多糖对多肽的化学修饰13-14
• 1.3.1 多肽的化学修饰13
• 1.3.2 壳寡糖作为修饰剂的优势13-14
• 1.4 本课题研究内容及拟解决的问题14-15
• 第2章 6-O季铵化壳寡糖-ES-2 修饰物（O-HTCCOS-ES-2）的合成与表征15-24
• 2.1 实验材料与试剂15
• 2.2 实验仪器和设备15-16
• 2.3 实验方法16-19
• 2.3.1 O-HTCCOS的合成16-17
• 2.3.2 O-HTCCOS红外光谱（IR）一维核磁共振氢谱（1H NMR ）分析17
• 2.3.3 茚三酮比色法测定O-HTCCOS的自由氨基含量17
• 2.3.4 O-HTCCOS-ES-2 的合成17-18
• 2.3.5 O-HTCCOS-ES-2 的分离纯化18
• 2.3.6 O-HTCCOS-ES-2 的MALDI-TOF-MS质谱鉴定18-19
• 2.4 实验结果19-22
• 2.4.1 O-HTCCOS的合成及IR和 1H NMR谱分析19-20
• 2.4.2 O-HTCCOS自由氨基率测定20-21
• 2.4.3 O-HTCCOS-ES-2 的分离纯化21-22
• 2.4.4 O-HTCCOS-ES-2 的MALDI-TOF-MS质谱分析22
• 2.5 讨论22-23
• 2.5.1 O-HTCCOS的合成与表征22
• 2.5.2 O-HTCCOS-ES-2 的合成与表征22-23
• 2.6 本章小结23-24
• 第3章 O-HTCCOS-ES-2 热稳定性和细胞亲和性研究24-29
• 3.1 实验材料与试剂24
• 3.2 实验仪器设备24
• 3.3 实验方法24-25
• 3.3.1 O-HTCCOS-ES-2 热稳定性研究24-25
• 3.3.2 细胞亲和性研究25
• 3.4 结果25-27
• 3.4.1 修饰前后的ES-2 热稳定性变化25-26
• 3.4.2 修饰前后的ES-细胞亲和性变化26-27
• 3.5 讨论27-28
• 3.5.1 O-HTCCOS-ES-2 热稳定性研究27-28
• 3.5.2 O-HTCCOS-ES-2 细胞亲和性研究28
• 3.6 本章小结28-29
• 第4章 O-HTCCOS-ES-2 的生物活性研究29-43
• 4.1 实验材料试剂29
• 4.2 实验仪器设备29
• 4.3 实验方法29-32
• 4.3.1 O-HTCCOS-ES-2 的体外抗新生血管生成活性研究29-30
• 4.3.2 O-HTCCOS-ES-2 的体内抗新生血管生成活性研究30-31
• 4.3.3 O-HTCCOS-ES-2 的抗细胞迁移作用研究31-32
• 4.4 结果32-41
• 4.4.1 O-HTCCOS-ES-2 的体外生物活性研究32-35
• 4.4.2 O-HTCCOS-ES-2 的体内生物活性研究35-38
• 4.4.3 O-HTCCOS-ES-2 的抗细胞迁移作用研究38-41
• 4.5 讨论41-42
• 4.5.1 O-HTCCOS-ES-2 的体外生物活性研究41
• 4.5.2 O-HTCCOS-ES-2 的体内生物活性研究41-42
• 4.5.3 O-HTCCOS-ES-2 的抗细胞迁移作用研究42
• 4.6 本章小结42-43
• 第5章 总结与展望43-46
• 5.1 总结43-44
• 5.2 展望44-46
• 参考文献46-50
• 在读期间发表的学术论文及研究成果50-51
• 致谢51

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