重组多肽CS5931的制备工艺优化及体内外抗结肠癌作用

发布时间：2017-06-09 21:32

  本文关键词：重组多肽CS5931的制备工艺优化及体内外抗结肠癌作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:对重组多肽CS5931的制备工艺进行优化,并研究其体内外抗结肠癌的作用,为将来的中试放大和药理学研究提供依据和实验基础。方法:1.以p ET28a为载体质粒,以大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌株,构建质粒p ET28a-CS5931和p ET28a-DDDK-CS5931并分别转化到表达菌株中,进行重组多肽CS5931和CS5931-EK的表达;将发酵所得菌体裂解后进行超声破碎离心处理,利用镍柱亲和层析法、使用仪器AKTA-Purifier 100进行多肽的分离纯化;利用SDS-PAGE和Western blot法检测重组多肽CS5931和CS5931-EK的表达。2.以大肠杆菌BL21(DE3)/p ET28a-CS5931为发酵菌株,从碳源、氮源、磷酸盐、Mg2+、诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的浓度、诱导温度、诱导时间等方面优化表达体系的发酵制备工艺。利用Plackett-Burman实验筛选出对重组多肽CS5931的表达影响最大的3个因素,并结合单因素实验结果设计响应面实验,通过中心组和实验(CCD)结果筛选出3个因素的最佳组合。3.利用单因素实验优化复性液成分,包括小分子物质甘油、尿素和谷胱甘肽,并检测了利用优化后的复性液进行复性所制备重组多肽CS5931的表达量及抗结肠癌细胞HCT116增殖的活性。4.利用MTT法评价重组萨氏海鞘多肽CS5931和CS5931-EK对体外结肠癌细胞HCT116的增殖抑制作用。建立人结肠癌细胞HCT116裸鼠移植瘤模型,并利用该模型考察重组萨氏海鞘多肽CS5931的体内抗结肠癌作用。结果:1.成功构建了p ET28a/CS5931质粒和p ET28a-DDDK-CS5931质粒并表达了重组多肽CS5931和CS5931-EK。重组多肽CS5931经分离纯化后呈单一条带,且纯度可达到98%。重组多肽CS5931和CS5931-EK的表达量分别为每升发酵液2.0 mg和1.5 mg。2.发酵制备工艺优化后的最佳发酵条件为酵母提取物浓度30 g/L,甘油浓度0.45%,IPTG浓度0.75 m M,诱导温度16℃,诱导时间20 h。优化后重组多肽CS5931的表达量从2.0 mg/L提高到7.5 mg/L,与优化前相比提高了2.75倍。3.优化后的复性液能够显著提高重组多肽CS5931的抗结肠癌细胞HCT116增殖的活性,对人结肠癌细胞HCT116的半数抑制浓度IC50值从23.2μM下降到11.6μM(活性增强1倍)。优化后复性液组分确定为50 m M Tris,0.5 m M EDTA,50 m M Na Cl,0.5 m M L-精氨酸,5%甘油,2 M尿素和2 m M/0.2 m M GSH/GSSH。4.所制备的重组多肽CS5931和CS5931-EK都具有显著的体外抗结肠癌细胞增殖的活性,His-tag的有无对重组多肽的抗结肠癌作用没有明显影响。体内实验表明重组多肽CS5931在25 mg/kg剂量时显著抑制人结肠癌HCT116裸鼠移植瘤的生长,且抗癌效果呈剂量依赖性,在同剂量(50 mg/kg)下抗癌效果优于阳性对照药环磷酰胺(CTX),同时用药期间未发现动物死亡,显示该重组多肽具有一定的安全性。结论:1.通过单因素实验,Plackett-Burman实验和中心组和实验对重组多肽CS5931的制备工艺进行了优化。使用优化后的工艺制备重组多肽CS5931,表达量从2.0 mg/L提高到7.5 mg/L,与优化前相比提高了2.75倍。复性液优化后可显著提高重组多肽CS5931的体外抗结肠癌细胞增殖活性,且His-tag的有无对重组多肽CS5931的抗结肠癌作用没有明显影响。2.所制备的重组多肽CS5931具有较好的体外和体内抗结肠癌作用,体外可显著抑制人结肠癌细胞HCT116的增殖;体内可显著抑制HCT116裸鼠移植瘤的生长,提示在结肠癌的治疗方面具有潜在的应用前景。
【关键词】：重组多肽CS5931 萨氏海鞘 抗肿瘤 工艺优化 复性 结肠癌
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-13
• 前言13-16
• 研究现状、成果13-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、重组多肽CS5931的原核表达及纯化16-28
• 1.1 对象和方法16-24
• 1.1.1 实验菌株16
• 1.1.2 实验试剂16-17
• 1.1.3 实验仪器17
• 1.1.4 实验方法17-24
• 1.2 结果24-26
• 1.2.1 重组多肽CS5931的纯化24
• 1.2.2 重组多肽CS5931的诱导表达结果及验证24-26
• 1.3 讨论26-27
• 1.4 小结27-28
• 二、重组多肽CS5931的发酵培养基及培养条件的优化28-45
• 2.1 对象和方法28-30
• 2.1.1 实验菌株28
• 2.1.2 实验试剂28
• 2.1.3 实验仪器28
• 2.1.4 实验方法28-30
• 2.2 结果30-43
• 2.2.1 单因素实验筛选结果30-37
• 2.2.2 Plackett Burman实验结果37-38
• 2.2.3 响应面试验结果及分析38-42
• 2.2.4 响应面结果预测评价42
• 2.2.5 培养条件的优化42-43
• 2.3 讨论43-44
• 2.4 小结44-45
• 三、重组多肽CS5931复性条件的优化及体外抗肿瘤活性评价45-54
• 3.1 对象和方法45-49
• 3.1.1 实验菌株45
• 3.1.2 实验试剂45
• 3.1.3 实验仪器45-46
• 3.1.4 实验方法46-49
• 3.2 结果49-52
• 3.2.1 人结肠癌细胞HCT116的生长特点49
• 3.2.2 不同复性条件对重组多肽CS5931抗人结肠癌活性的影响49-51
• 3.2.3 复性条件的验证51-52
• 3.2.4 MTT法检测重组多肽CS5931和重组多肽CS5931-EK的活性52
• 3.3 讨论52-53
• 3.4 小结53-54
• 四、重组多肽CS5931的体内抗肿瘤活性评价54-57
• 4.1 对象和方法54
• 4.1.1 实验对象54
• 4.1.2 实验试剂54
• 4.1.3 实验仪器54
• 4.1.4 实验方法54
• 4.2 结果54-56
• 4.2.1 重组多肽CS5931对人结肠癌HCT116裸鼠移植瘤的生长抑制作用结果54-56
• 4.3 讨论56
• 4.4 小结56-57
• 结论57-58
• 参考文献58-60
• 发表论文和参加科研情况说明60-61
• 综述 多肽类抗肿瘤药物的研究进展61-76
• 综述参考文献69-76
• 致谢76-77
• 个人简历77

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本文编号：436706