miR-33-5p在小鼠失重性骨质丢失中的作用及其机制研究

发布时间：2017-09-06 17:03

  本文关键词：miR-33-5p在小鼠失重性骨质丢失中的作用及其机制研究

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【摘要】：研究背景随着我国航天事业的蓬勃发展,中长期载人航天活动已经进入初步实施阶段。长时间处于失重环境对航天员造成的不良影响亟待我们深入研究并开发有效的防护措施。长时间暴露于失重环境会导致快速且严重的骨质丢失,是目前限制人类进行远距离航天飞行的主要医学问题。目前已采取了防护设备、体育锻炼、营养补充以及物理治疗等措施试图解决失重性骨质丢失这一问题,但其效果均不理想。想要找到解决这一难题的有效办法,充分研究其发生机制是一条必由之路。miRNA是一类可以对广泛的生命活动过程发挥调控作用的短链非编码RNA,参与了多种疾病的发生与发展。近年来miRNA在各种疾病中的作用研究也愈趋成熟,它的研究也逐渐从单纯机制探讨向临床应用发展,如作为药物干预的靶点、疾病早期诊断或病程判断的标志物。从骨骼系统的发育、成熟到各种骨骼疾病的发生,均有研究发现了多个miRNAs参与到了其中。miRNA也调控着成骨细胞、破骨细胞等骨组织中重要细胞的功能。但miRNA在失重性骨质丢失的发生发展过程中的作用,目前还鲜有研究。已有研究发现,失重环境下成骨细胞功能降低是导致失重性骨质丢失的重要原因。近年来,本课题组以成骨细胞为研究对象,依据失重所致成骨细胞功能下降过程中miRNA的变化特点,发现了在模拟失重环境下调控成骨细胞功能的多种miRNAs,并陆续研究了其作用机制,本项研究也是该项工作的一部分。目的本课题旨在从前期研究关注的候选miRNAs中选出在成骨细胞模拟失重环境下显著差异表达的miRNA;明确其对成骨细胞功能的影响,并进一步探讨其作用机制;最后以该miRNA为干预靶点,对小鼠尾吊模拟失重模型中骨质丢失实施干预研究。方法1.采用SYBR Green法q RT-PCR与Taq Man探针法从候选miRNAs中选出回转模拟失重环境下成骨细胞内差异表达显著的miRNA,并研究其表达的时程变化。2.使用miR-33-5p的mimic和inhibitor在成骨细胞中进行获得性和缺失性功能研究:以成骨细胞分化标志物Runx2、Osx和ALP作为成骨细胞分化指标,q RT-PCR检测其m RNA表达,Western Blot检测Runx2与Osx蛋白表达,ALP活性与ALP染色检测ALP的蛋白功能;CCK-8法检测成骨细胞的增殖能力,另以PCNA作为增殖的标志物,采用PCNA蛋白含量检测平行验证CCK-8的实验结果;茜素红染色及其半定量分析检测成骨细胞的矿化功能;过表达成骨细胞中miR-33-5p,检测过表达miR-33-5p是否可对抗模拟失重对成骨细胞分化的抑制作用。3.以荧光素酶报告基因实验验证miR-33-5p与预测所得靶基因Hmga2的直接结合关系,并以q RT-PCR、Western blot与免疫荧光染色检测过表达或敲低miR-33-5p对Hmga2的影响,并进一步研究Hmga2在回转模拟失重环境下的变化特点。通过过表达质粒或si RNA在成骨细胞中过表达或敲低Hmga2,从而研究其对成骨细胞分化功能的影响。进而通过miR-33-5p与Hmga2的调节因子共转染的方式,验证miR-33-5p是否通过Hmga2影响成骨细胞分化。4.使用(AspSerSer)6-liposome成骨靶向递送系统包裹miR-33-5p的类似物agomir-33,在体内特异性地提高骨形成区成骨细胞中miR-33-5p的表达。使用micro CT、生物力学三点弯曲试验、钙黄绿素双标实验、马松染色以及骨组织成骨细胞分化指标检测的方法,从多角度观察靶向补充成骨细胞中miR-33-5p对尾吊模拟小鼠失重性骨质丢失的防护作用。结果1.在回转模拟失重环境下,成骨细胞中miR-33-5p的表达显著下降,且随失重时间延长表达下降程度增大。2.miR-33-5p上调成骨细胞Runx2、Osx与ALP的表达,且miR-33-5p在成骨细胞分化过程中表达增加;补充miR-33-5p部分逆转了回转模拟失重所致的成骨细胞Runx2、Osx与ALP表达降低;miR-33-5p促进成骨细胞矿化结节的产生;miR-33-5p不影响成骨细胞PCNA蛋白表达与CCK-8法检测的细胞增殖活性。3.miR-33-5p可与Hmga2的3’UTR区直接结合;miR-33-5p不影响Hmga2 m RNA表达而抑制其蛋白表达;回转模拟失重环境下Hmga2的表达升高;Hmga2下调成骨细胞Runx2、Osx与ALP的表达,且Hmga2在成骨细胞分化过程中表达下降;干预Hmga2的表达可以削弱miR-33-5p对成骨细胞Runx2、Osx与ALP表达的调控作用。4.在体靶向提高成骨细胞miR-33-5p的表达可以部分缓解尾吊小鼠股骨成骨细胞功能的下降、新生骨质的减少、骨小梁结构的破坏与股骨抗弯曲载荷能力的降低。结论1.模拟失重环境下成骨细胞miR-33-5p的表达显著下降。2.miR-33-5p促进成骨细胞分化与矿化,对增殖无显著影响。在成骨细胞中补充miR-33-5p可以部分恢复回转模拟失重所致的成骨细胞分化抑制。3.Hmga2是miR-33-5p的靶基因,且miR-33-5p在转录后水平抑制其表达。Hmga2抑制成骨细胞分化,且在模拟失重环境下表达升高。miR-33-5p对成骨细胞分化的调控作用是部分通过Hmga2完成的。4.在体靶向提高成骨细胞miR-33-5p表达可以部分减缓尾吊小鼠股骨的骨质丢失。综上所述,我们发现模拟失重通过降低miR-33-5p从而抑制成骨细胞的分化与矿化,其机制是模拟失重减弱了miR-33-5p对抑分化因子Hmga2的抑制作用,且在体靶向提高成骨细胞miR-33-5p表达水平可以部分减缓尾吊小鼠股骨的骨质丢失。我们的研究结果进一步阐明了失重性骨质丢失的细胞学机制,也为开发新型失重性骨质丢失防护措施提供了理论依据。
【关键词】：模拟失重 成骨细胞 细胞分化 miR-33-5p Hmga2
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R852.22
【目录】：

• 缩略语表4-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-31
• 第一部分 模拟失重环境下MC3T3-E1前成骨细胞中差异表达miRNA的筛选31-41
• 1 材料31-33
• 2 方法33-37
• 3 结果37-39
• 4 讨论39-41
• 第二部分 miR335p对MC3T3-E1前成骨细胞的调控作用41-56
• 1 材料41-43
• 2 方法43-46
• 3 结果46-53
• 4 讨论53-56
• 第三部分 miR335p调控MC3T3-E1前成骨细胞分化的机制研究56-74
• 1 材料56-58
• 2 方法58-61
• 3 结果61-72
• 4 讨论72-74
• 第四部分 靶向补充成骨细胞中miR335p对尾吊小鼠骨质丢失的防护作用74-89
• 1 材料75-76
• 2 方法76-79
• 3 结果79-87
• 4 讨论87-89
• 小结89-90
• 参考文献90-100
• 个人简历和研究成果100-102
• 致谢102-103

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1 王瀚;miR-33-5p在小鼠失重性骨质丢失中的作用及其机制研究[D];第四军医大学;2016年

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本文编号：804341