肌钙蛋白I亚基NH2-末端磷酸化对心肌舒张功能的调节作用

发布时间：2017-10-02 01:04

  本文关键词：肌钙蛋白I亚基NH2-末端磷酸化对心肌舒张功能的调节作用

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【摘要】： 心肌肌钙蛋白I亚基(cardiac troponin I, cTnI)在心肌收缩调节中发挥了“分子开关”的重要作用。cTnI的调节方式分为磷酸化和非磷酸化两种。蛋白降解作为cTnI非磷酸化调节方式,可通过降解cTnI上含磷酸化的片段,达到间接去磷酸化的调节作用;或者降解其重要的结构域,改变分子的空间构象,达到调节心肌收缩性能的目的。 本实验室以往研究发现尾部悬吊模拟失重四周的大鼠心肌内cTnI的NH2-末端降解增加,降解后的cTnI缺失了PKA的磷酸化位点第23/24位丝氨酸。PKA磷酸化cTnI后可降低肌丝的Ca2+敏感性,加速Ca2+从肌丝上解离,促进心肌舒张。PKA介导的cTnI磷酸化还可以提高横桥循环速度,增加心肌无负荷收缩速度的作用。如果该磷酸化位点被去除,就有可能影响大鼠心肌收缩性能的调节,特别是心肌对于β-肾上腺素能受体激动剂的反应性。为观察cTnI NH2-末端的降解是否会对模拟失重大鼠心脏收缩功能产生调节作用,我们利用离体工作心脏灌流、心肌单细胞无负荷收缩功能测量、裸露肌纤维张力-pCa关系曲线测量、Western Blot和免疫组化染色等多种技术,对尾部悬吊模拟失重大鼠心肌进行多层次检测,主要结果如下: 1.模拟失重大鼠的离体工作心脏对于异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO)的反应性降低。在10 mmHg的前负荷与60 mmHg的后负荷下,模拟失重组的心输出量与对照组相比无明显差异,但心率明显高于对照组。ISO作用后,模拟失重组心输出量和心率的增加低于对照组。模拟失重组在基础状态下,左心室舒张末期压力(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)和心室内压力最大舒张速度(maximal rate of left ventricular pressure development, -dP/dtmax)均低于对照组。ISO灌流后LVEDP的降低和-dP/dtmax的增加程度仍显著低于对照组。 2.模拟失重组心肌细胞对于β-肾上腺素能受体信号转导通路中几个重要环节激动剂的反应性降低。模拟失重组心肌细胞收缩的频率依赖性反应存在,但其在1 Hz、2 Hz和4 Hz频率下的收缩幅值低于对照组。在进行了β-肾上腺素受体激动剂ISO,腺苷酸环化酶激动剂forskolin, cAMP的模拟剂DB-cAMP和可抑制cAMP降解的IBMX等药物灌流后,模拟失重组心肌细胞的收缩幅值仍低于对照组。在ISO,forskolin,DB-cAMP和IBMX最大浓度的作用下,模拟失重组心肌细胞收缩和舒张速度的增幅低于对照组,其收缩和舒张时间的降低程度也低于对照组。 3. PKA磷酸化引起的裸露肌纤维Ca2+敏感性降低作用在模拟失重后受到限制。模拟失重组和对照组裸露肌纤维的Ca2+敏感性无明显差异,使用PKA催化亚基作用后,两组的Ca2+敏感性均发生明显降低,但模拟失重组的降低程度低于对照组。 4. Western Blot结果显示,模拟失重组和对照组心肌内均存在cTnI的降解片段,但模拟失重组cTnI的降解片段占总cTnI的比例高于对照组。模拟失重组cTnI的磷酸化水平无论在基础状态下还是20 nM ISO作用后均明显低于对照组。 5. Western blot和免疫组化结果显示,20 nM ISO作用前后,模拟失重组PKA活化亚基的表达水平与对照组相比均无明显差异,ISO作用后PKA的活化增强,并且产生向细胞膜的转位,但两组之间仍无明显差异。 6. Western blot结果显示,模拟失重组PLB的表达水平未发生改变,20 nM ISO作用后第16位丝氨酸发生磷酸化的PLB占总PLB的比例与对照组相比也无明显差异。 以上结果表明,cTnI NH2-末端降解增加是模拟失重大鼠心脏舒张功能降低的一个重要影响因素。而心脏舒张功能增强受限可能会减少模拟失重大鼠的心输出量,这可能是引起航天员在返回地面后出现立位耐力不良的因素之一。 为进一步探讨cTnI NH2-末端及其磷酸化在增强心肌舒张功能方面发挥的作用,本文还比较了异丙肾上腺素依赖性舒张功能增强和频率依赖性舒张功能增强这两种不同的途径在增强心脏舒张功能方面的差异。主要结果如下: 1.在增强离体工作心脏舒张功能的方面,ISO灌流高于单纯提高刺激频率。20 nM ISO作用后离体工作心脏的心率达到300 beats/min左右,LVEDP明显降低,而300 beats/min的电刺激则显著提高LVEDP。最大舒张速度-dP/dtmax在ISO和电刺激的作用下表现出与LVEDP类似的反应。ISO和单纯提高刺激频率都可减少舒张时间,但ISO减少舒张时间大于单纯提高心率。在灌流不同浓度ISO时,再给予离体工作心脏较高的刺激频率如420 beats/min后,灌流10 nM ISO的舒张时间缩短最为显著。 2. ISO有利于心肌细胞舒张期Ca2+再摄取,提高心肌细胞的收缩和舒张功能。细胞内Ca2+瞬变的峰值和静息Ca2+浓度均随刺激频率提高而增加,过高的刺激频率(5 Hz)反而降低细胞内Ca2+瞬变的峰值。灌流ISO后,心肌细胞内Ca2+瞬变的峰值明显提高,而静息Ca2+浓度有所下降。在灌流ISO的同时提高刺激频率,细胞内静息Ca2+浓度仍随刺激频率的提高而有所增加,但增加幅值明显低于单纯提高刺激频率。ISO缩短细胞内Ca2+瞬变舒张时间大于单纯提高刺激频率。 3. cTnI第23/24位丝氨酸的磷酸化水平随ISO的灌流浓度增加而显著提高。而提高工作心脏的刺激频率对cTnI第23/24位丝氨酸的磷酸化水平无明显影响。 4. PLB第16位丝氨酸和第17位苏氨酸的磷酸化水平均随着ISO的浓度提高而提高,但第16位丝氨酸的增加程度更为显著。单纯提高工作心脏的刺激频率可明显提高PLB第17位苏氨酸的磷酸化水平,但对第16位丝氨酸的磷酸化水平无明显影响。灌流ISO的同时提高刺激频率,还可继续增加PLB第17位苏氨酸的磷酸化水平。 以上结果表明,提高刺激频率仅磷酸化PLB第17位苏氨酸,故舒张功能增强作用较弱,而ISO同时磷酸化PLB和cTnI,使得PLB和cTnI之间产生协同效应,所以对舒张功能具有更明显的增强作用。
【关键词】：尾部悬吊大鼠 心脏舒张功能 异丙肾上腺素 心肌肌钙蛋白I亚基 降解 异丙肾上腺素依赖性舒张功能增强 频率依赖性舒张功能增强
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R85
【目录】：

• 缩略语表5-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-17
• 文献回顾17-34
• 正文34-103
• 一、增加cTnI NH_2-末端降解损害尾部悬吊大鼠心脏舒张功能34-77
• 1 引言34-35
• 2 实验方法35-47
• 3 结果47-72
• 4 讨论72-77
• 二、cTnI 磷酸化促进心肌频率依赖性舒张功能增强效应77-103
• 1 引言77-79
• 2 实验方法79-82
• 3 结果82-98
• 4 讨论98-103
• 总结与展望103-105
• 参考文献105-123
• 个人简历和研究成果123-125
• 致谢125

【参考文献】

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1 陈杰,马进,丁兆平,张立藩;一种模拟长期失重影响的大鼠尾部悬吊模型[J];空间科学学报;1993年02期

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本文编号：956653