中药肉苁蓉的化学成分组及抗血管性痴呆的体内药效物质研究

发布时间：2020-03-18 02:00

【摘要】：肉苁蓉(Cistanches Herba)为名贵中药,有较高的药用和食用价值,被誉为“沙漠人参”。近年来,针对肉苁蓉的化学成分定性、定量研究不断深入,但主要集中于苯乙醇苷类化学成分研究上,尚未见对其大极性和中、小极性成分的同步定性、定量分析的报道。苯乙醇苷类化合物为肉苁蓉中主要活性成分,结构中含有多个不稳定基团,易在分析过程中降解而影响分析结果的准确性,因此,需要建立可靠的分析手段对肉苁蓉进行精确质量分析。以肉苁蓉总苷为原料的苁蓉总苷胶囊在临床中广泛应用于髓海不足证造成的轻、中度血管性痴呆,但体内药效物质及作用机理尚未明确。因此,本论文针对以上研究缺陷,对肉苁蓉的体内外化学成分进行系统研究,并利用药物代谢组学方法探索肉苁蓉抗血管性痴呆的体内药效物质和作用机制,以期提高肉苁蓉质量分析方法,为肉苁蓉的临床应用及相关药物的开发提供参考。具体研究内容和结果如下:1.肉苁蓉化学成分的全面定性定量分析建立加压溶剂提取模块(PLE),实现肉苁蓉样品快速微量(约1mg)提取,通过LC-IT-TOF-MS分析肉苁蓉超声提取和加压溶剂提取方法的提取效率,验证了加压溶剂提取模块能够实现化学成分的高效提取。利用IT-TOF-MS高分辨质谱丰富的多级质谱信息,系统总结了肉苁蓉主要成分苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类化合物的质谱裂解规律,并鉴定肉苁蓉中79个化学成分。同时,将加压溶剂提取模块与高效液相色谱在线连接,构建PLE-TFC-HPLC-DAD系统实现了肉苁蓉中8个苯乙醇苷类成分的快速同步定量分析,方法学考察结果显示该方法能够实现肉苁蓉的快速、准确定量。PLE系统的建立和应用,减少了分析过程中样品和有机溶剂的用量,节约了制备样品的时间,降低了不稳定成分在处理过程中降解的可能性,实现了肉苁蓉样品直接、快速的在线分析,同时也为中药和生物样品等固体复杂基质的分析提供了可靠、快速的绿色分析方法。为阐明肉苁蓉体内代谢物,首先对肉苁蓉化学成分组进行深入解析。采用Qtrap-MS质谱的多种扫描模式,如预测多反应监测模式(pMRM)、中性丢失扫描(NL)、母离子扫描(Prec)、增强子离子扫描(EPI)和增强质谱扫描(EMS)等,利用高分辨质谱研究的质谱裂解规律,建立基于特征碎片的NL162Da、146Da等中性丢失扫描方法和Prec m/z 161、m/z 145等母离子扫描方法,对苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类等主要化学类型进行深度挖掘,并基于HMDB等数据库建立pMRM方法检测初级代谢产物。综上,共检测到肉苁蓉中513个化学成分,基本阐明了肉苁蓉化学成分组。采用反相色谱-亲水作用色谱-质谱联用系统(RPLC-HILIC-MS/MS)对肉苁蓉中的大、中和小极性27个成分,如氨基酸、核苷、苯乙醇苷、糖类等,进行了同步定量分析。利用在线质谱参数优化策略对肉苁蓉中含量高的松果菊苷、毛蕊花糖苷、甘露糖醇质谱响应进行选择性抑制,并采用高灵敏度的sMRM模式保证低含量化学成分的检出。方法学考察结果表明该系统能够扩展检测线性范围、增强对极性化合物的保留,适用于肉苁蓉中极性跨度大、含量差异大的多成分同步含量测定,也为其他中药的多成分全面质量控制提供可靠的方法。2.肉苁蓉的体内化学成分分析基于亚结构拆分和结构简化策略,采用LC-MS技术对酪醇、羟基酪醇、咖啡酸、红景天苷、肉苁蓉苷F、脱羧基迷迭香酸、毛蕊花糖苷、松果菊苷以及肉苁蓉的体内代谢过程进行系统研究。发现苯乙醇苷、苯丙素苷以及含酯键的化合物灌胃大鼠后酯键和苷键发生断裂,易在体内发生水解反应,充分阐明了肉苁蓉的体内代谢产物是主要是苯乙醇苷类降解产物羟基酪醇(HT)、咖啡酸(CA)、高香草酸(HVA)、阿魏酸、3-羟基苯丙酸(3-HPP)等,以磺酸化形式进入血液,经尿液排泄。通过各单体化合物以及肉苁蓉体内代谢物组的系统分析,单体和肉苁蓉血浆中的代谢物体内达峰时间不同,单体化合物的体内代谢过程并不能代表中药复杂成分的体内真实代谢过程。本论文从单体到总提物的体内过程系统研究,提供了丰富的肉苁蓉代谢物组信息,也为中药体内代谢研究提供新思路。3.基于药物代谢组学的肉苁蓉抗血管性痴呆研究建立了双侧颈总动脉(2VO)结扎所致的大鼠血管性痴呆模型,通过Morris水迷宫实验以及病理切片结果,发现肉苁蓉总苷提取物(CG)给药后能够减轻2VO所致的海马神经元的损伤,并显著改善大鼠的学习记忆能力。建立基于LC-MS技术的药物代谢组学方法,并研究了肉苁蓉对血管性痴呆大鼠血浆代谢物组(metabolome)的影响。多元统计分析结果表明给药组和模型组之间以及模型组与假手术组之间血浆内源性代谢物水平存在差异,并初步鉴定了39个血管性痴呆相关差异代谢物。与模型组大鼠相比,CG给药组显著调节了26个内源性代谢物。进一步分析差异代谢物涉及的代谢通路,发现肉苁蓉给药后的HT、HVA、3-HPP等主要代谢产物,能够直接参与芳香族氨基酸代谢,如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等代谢通路,从而参与调节血管性痴呆的神经递质代谢紊乱。同时,甘油磷脂代谢以及花生四烯酸代谢等通路也受到调节。因此,肉苁蓉可能通过其代谢产物参与调节神经递质代谢,改善脂质代谢紊乱、抗氧化损伤、促进抗炎反应等途径发挥抗血管性痴呆作用。通过对HT、HVA等潜在药效物质的活性验证,发现其都能够抑制OGD/R诱导的HUVEC细胞损伤,从而发挥对脑血管内皮细胞保护作用,进一步说明肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物的体内代谢产物为肉苁蓉抗血管性痴呆的主要药效物质。综上所述,本论文建立了肉苁蓉的全成分定性、定量分析方法,阐明了肉苁蓉的化学成分组,系统研究了肉苁蓉的体内代谢产物,初步阐明了肉苁蓉抗血管性痴呆的药效物质为苯乙醇苷类化合物的体内降解产物,肉苁蓉可能通过代谢产物直接参与神经递质代谢、调节脂质代谢等多途径发挥抗血管性痴呆的药效。
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蓉防治血管性痴呆的体内药效物质及可能的作用机制，为肉苁蓉通过“补精益髓”理论逡逑治疗神经退行性疾病提供依据。逡逑具体研宄路线如图５所示。本研究以ＬＣ邋ＭＳ为主要技术手段，建立肉苁蓉体内外逡逑化学成分的定性定量方法，，阐明肉苁蓉化学物质组以及代谢物组，基于药物代谢组学方逡逑法和体外活性验证，系统研究肉苁蓉防治血管性痴呆的体内药效物质及可能的作用机逡逑制。本研宄的开展同时也为基于代谢组学的中药药效物质研究提供有效参考，为中药体逡逑内外成分的全面分析以及药效物质研究提供思路和方法。逡逑产建立在线加压提取方法；逦产ＩＴ－ＴＯＦ－ＭＳ分析；逡逑，建立ＲＰＬＣ／ＨＩＬＩＣ方法；逦，Ｑ邋Ｅｘａｃｔｉｖｅ－ＭＳ分析；逡逑产建立ＲＰＬＣ－ＨＩＬＩＣ系统逦，Ｑｔｒａｐ－ＭＳ分析逡逑大鼠血浆、尿液、逡逑１逦１逦粪便、胆汁逡逑定性分析逦定量分析逡逑体内代谢逡逑产物鉴定逡逑＂逦裂解规律总结逡逑构建化学成分组逦构建体内代谢物组逡逑２Ｖ0大鼠模型一：ＩＳ片逡逑体外活性验证逦药物代谢组学逡逑ｒ多元统计分析；逡逑，Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ邋＜＾１软件；逡逑

提取溶剂以２．５邋ｍＬ／ｍｉｎ流速进入系统时，产生提取所需的反压（约１３．０邋ＭＰａ），从而逡逑实现加压溶剂微提取。将整个提取模块连接于进样器后面，并置于柱温箱中给予一定温逡逑度（７０°Ｃ），降低水的极性和粘度，提高提取效率。具体装置及工作原理示意图见图６。逡逑２９逡逑
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5;R284


本文编号：2588041