巴戟天环烯醚萜苷类成分抗类风湿性关节炎的作用研究

发布时间：2020-03-18 18:16

【摘要】：类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性进行性的自身免疫性疾病,其病理特点是多关节受累,滑膜炎持久反复发作,病情缠绵难愈,可导致关节内软骨和骨的破坏。中医理论认为RA是由于肝肾亏损及寒湿阻络引起的,其治疗应采用补肝肾、祛风除湿、活血通络的方法。中药巴戟天为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的根,性温,味辛、甘,归肝、肾经;具有补肾阳,强筋骨,祛风湿的作用。研究表明巴戟天环烯醚萜苷类成分具有显著的抗炎活性。课题组前期研究发现巴戟天乙醇提取物能有效抑制佐剂性关节炎大鼠踝关节的急性炎症反应,降低血清IL-1β和TFN-α的水平,而环烯醚萜苷类成分为巴戟天抗炎和防治大鼠关节炎的有效成分。目的:明确巴戟天环烯醚萜苷类成分抗炎和抗类风湿新关节炎的作用及机制,为巴戟天资源的开发利用及新药研究开发提供科学依据。方法:1.以巴戟天环烯醚萜苷类成分水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、车叶草苷酸和车叶草苷为对照品,建立HPLC法测定巴戟天环烯醚萜苷类成分的方法。采用大孔吸附树脂富集巴戟天中环烯醚萜苷类成分,以获得巴戟天总环烯醚萜苷。2.按照最大给药容量、最大药物溶解浓度,小鼠单次灌胃给予巴戟天总环烯醚萜苷,观察给药后小鼠14天内的毒性反应及死亡情况。通过小鼠醋酸扭体实验、小鼠气囊肉芽肿实验和大鼠棉球肉芽肿实验,研究巴戟天总环烯醚萜苷的抗炎镇痛作用。以LPS刺激的RAW264.7细胞为模型,初步研究巴戟天总环烯醚萜苷抗炎的作用机制。3.应用弗氏佐剂诱导大鼠关节炎模型,以去卵巢联合Ⅱ型胶原诱导小鼠肾虚痹症模型,通过观察小鼠和大鼠的足趾肿胀度、关节炎指数、血清生化指标和滑膜组织的病理变化,评价巴戟天总环烯醚萜苷抗类风湿性关节炎的作用。以TNF-α刺激的人成纤维滑膜细胞为模型,初步探讨巴戟天总环烯醚萜苷的作用机制。结果:1.所建立的HPLC方法可用于巴戟天中环烯醚萜苷类成分的含量测定。水晶兰苷、去乙酰车叶草苷酸、车叶草苷酸和车叶草苷在0.375-12μg,0.13-4.16μg,0.016-0.516μg和0.012-0.384μg范围内,与峰面积的线性关系良好;重复性、稳定性、精密度和加样回收率试验结果均符合要求。经大孔树脂富集,可得到含量为62%的巴戟天总环烯醚萜苷。2.急性毒性结果表明,巴戟天总环烯醚萜苷对小鼠没有明显的毒副作用。巴戟天总环烯醚萜苷在50mg/kg,100mg/kg和200mg/kg的剂量下,均可显著减少醋酸扭体试验中小鼠的扭体次数,减少小鼠气囊肉芽肿和大鼠棉球肉芽肿实验中肉芽肿的干重和湿重,表明巴戟天总环烯醚萜苷具有显著的抗炎和镇痛作用。巴戟天总环烯醚萜苷及其主要成分水晶兰苷显著抑制LPS刺激的RAW264.7产生IL-1β、IL-6和NO,抑制RAW264.7细胞中iNOS和COX-2蛋白的表达,及NF-?B通路中的蛋白表达,表明巴戟天环烯醚萜苷通过NF-?B通路产生抗炎作用。3.巴戟天总环烯醚萜苷能够减轻弗氏完全佐剂诱导的大鼠关节炎症状,显著降低大鼠血清炎症细胞因子IL-6、IL-1β和IL-17a的水平,显示出良好的抗类风湿性关节炎的作用。在去卵巢和Ⅱ型胶原联合诱导的小鼠肾虚痹症关节炎模型中,巴戟天总环烯醚萜苷能够改善小鼠的关节炎症状,显著降低小鼠血清炎症细胞因子IL-6和IL-10的水平,减缓关节炎小鼠滑膜组织的增生,显示出良好的抗类风湿性关节炎作用。同时,巴戟天总环烯醚萜苷能够增加肾虚痹症关节炎小鼠血清骨形成指标骨钙素的含量,降低血清碱性磷酸酶的活性,显著降低血清骨吸收指标DPD和RANKL的水平,显著增加小鼠股骨的骨密度和骨矿物质含量,增加骨小梁数目,降低骨小梁分离度,改善骨组织的微结构,具有良好的改善肾虚痹症小鼠骨丢失和骨质破坏的作用。巴戟天总环烯醚萜苷及水晶兰苷能显著抑制TNF-α刺激的滑膜成纤维细胞的增殖及IL-6、IL-8的产生,具有抑制滑膜增生的作用。结论:巴戟天总环烯醚萜苷具有确切的抗炎和抗类风湿性关节炎作用,可为巴戟天资源的开发利用和中药新药研制提供科学的依据。
【图文】：

色谱图,混合对,提取物,巴戟天

乙醇等试剂为分析纯.1.3 材料巴戟天 2015 年 4 月购于广西玉林和安徽亳州药材市场，产地分别为：广西、广东福建。由第二军医大学药学院生药学教研室张巧艳教授鉴定为茜草科 Rubiaceae 植巴戟天 Morinda officinlis How.的干燥根。.2 实验方法.2.1 巴戟天环烯醚萜苷的含量测定方法.2.1.1 色谱条件艾杰尔 VenusilMPCl8（250mm×4.6mm,5μm）色谱柱，流动相：乙腈（A）-0.2%酸+0.01moL/L 磷酸氢二钠缓冲盐（B）梯度洗脱（0~12min,1%~2%A;12~30min% ~25% A）；检测波长：235 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20μL；照品和样品色谱图见图 2-1。

曲线,水晶,线性范围,曲线

佳木斯大学硕士学位论线性范围 0.13~4.16μg；车叶草甘酸 Y=15883X+6.294，r=0.9997，线性范围 0.016~0μg；车叶草苷 Y=14329X-2.533，r=0.9995，线性范围 0.012~0.384μg。以上结果表明水晶兰苷、去乙酰车叶草苷酸、车叶草苷酸、车叶草苷在相应的浓度范围内线性关良好。
【学位授予单位】：佳木斯大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284;R285

【参考文献】