基于“肠道菌群-肠-肝轴”探究贻贝多糖对NAFLD的药效及作用机理

发布时间：2020-03-19 12:40

【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是全球主要的慢性肝病,不仅在中国、日本等亚洲国家,而且在大多数西方发达国家中都越来越普遍,并且与肥胖,糖尿病和代谢综合征密切相关。NAFLD可发展成非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、进行性肝纤维化,最终可发展成肝硬化和肝癌。然而,该疾病发病机制复杂,目前仍未得到很好的阐明。由于门静脉系统可将肠腔与肝脏的结构和功能紧密联系,研究已发现并证实肠道菌群在NAFLD的发病机理中起关键作用。此外,饮食可显著调节肠道微生物组和NAFLD发展相关的代谢途径,表明肠道、饮食和肝脏之间也密切相关。其主要表现有,受不同类型饮食习惯的影响,肠道菌群代谢物如乙醇、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)的生产水平可发生显著变化,直接或间接地影响着机体肝脏组织表型变化,参与单纯性肝脂肪变性、NASH、肝硬化等各个病理阶段。这也为NAFLD临床防治提供了一个新思路。此前,已有报道表明,从贻贝当中提取出来的生物多糖(mussel polysaccharides,MPs)具有多种生物活性,如调节免疫力、调血脂、抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗肿瘤等作用。前期工作中,课题组从贻贝中提取出一种新型贻贝多糖“α-D-葡聚糖”(mussel polysaccharide α-D-Glucan,MP-A),并在预实验中发现MP-A有调节肝脏TG水平的作用,推测其可能对NALFD具有防治作用,然而至今未见任何一种MPs在此方面的报道。本课题将结合肠道菌群在NAFLD发生发展中的作用机制,使用高脂饮食(high fat diet,HFD)诱导法构建体内动物模型,研究MP-A对NAFLD的药效作用及探究其机制,为其开发和临床应用提供理论支持。1 MP-A对高脂饮食大鼠的肝保护作用目的:通过体内实验评价MP-A对HFD诱导的NAFLD模型大鼠的肝保护作用。方法:使用HFD诱导法构建NAFLD模型大鼠。42只大鼠随机分成6组:正常组、HFD组、MP-A(110 mg/kg)组、MP-A(300 mg/kg)组、MP-A(600 mg/kg)组、血脂康组,每组6只。除正常组外,其余大鼠均喂食高脂饲料。每周测量一次体重和摄食量。从第3周起,各实验处理组开始灌胃给药,正常组和HFD组灌胃相同体积的溶剂。在第8周结束时,对各组大鼠进行麻醉采血,然后处死。对各组大鼠的摄食量、体重、肝重、血脂水平、肝脏甘油三酯(triglyceride,TG)水平及肝脏病理情况进行分析评估。结果:MP-A可在不影响摄食量的情况下,显著地减缓大鼠体重增长速率和降低血脂水平,并与给药剂量呈正相关。此外,MP-A可显著降低NAFLD模型大鼠的相对肝重和肝脏TG水平,有效缓解HFD大鼠肝脏的脂质沉积。结合大体标本的肉眼观察结果,我们可进一步确定MP-A对HFD大鼠肝脂肪变性缓解作用。其中,MP-A剂量为100 mg/kg时,大鼠肝脏中TG水平与血脂康216 mg/kg相当。结论:MP-A对NAFLD模型大鼠具有肝保护作用,且优于血脂康,呈剂量依赖性。2 MP-A对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠的肠道菌群结构的调控目的:考察MP-A对HFD诱导的NAFLD模型大鼠的肠道菌群影响。方法:采用HFD诱导方构建NAFLD模型大鼠。18只大鼠随机分成3组:正常组、HFD组、MP-A(600 mg/kg)组,每组6只。除正常组外,其余大鼠均喂食高脂饲料。每周测量一次体重和摄食量。自第3周起,进行MP-A干预。正常组和HFD组灌胃相同体积的溶剂。第8周结束时,对各组大鼠进行麻醉采血,即可处死,然后采集肝脏、门静脉血液和盲肠内容物。测量肝重,并对其进行病理切片染色、观察和评分;测量肝功能指标、血脂和肝内TG水平;对盲肠内容物进行宏基因组测序和多变量分析。结果:MP-A可显著地减缓体重、肝重的增长速率,降低NAFLD模型大鼠的肝脏TG和血脂水平,且对大鼠的摄食量无明显影响。同时,结合肝组织病理切片观察和肝功能指标结果,进一步证实MP-A可减轻HFD引起的肝损伤。肠道菌群测序结果显示,18个样品中可获得511,812条高质量序列。根据97%相似度,将其归类成6115个操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs),进行了 α和β多样性分析及物种注释后的聚类分析。α和β多样性分析结果表明,MP-A可以提高菌群的丰富程度和维持菌群的基本生态结构与分布。从门水平的聚类分析结果来看,MP-A可提高因HFD诱导而降低的拟杆菌门的丰度,抑制HFD引起的厚壁菌门和变形杆菌门丰度升高。从属水平来看,共有63个菌属因HFD丰度发生了显著变化。经过MP-A的干预后,其中的13个菌属丰度可被显著改善。结合实验结果并经文献调研,我们发现MP-A可显著提高Alloprevotella,Akkermansia,双歧杆菌和Butyricimonas这四个益生菌丰度。MP-A还可显著降低致病菌Turicibacter的丰度。结论:MP-A可通过重塑菌群的生态分布,提高菌群多样性和部分益生菌的丰度,还可降低某些病原微生物的丰度,对高NAFLD模型大鼠的肠道菌群具有调节和保护作用。3 MP-A对“肠道菌群-肠-肝”轴相关信号通路的调节目的:考察MP-A对肠道菌群代谢产物及其相关“肠-肝”轴信号通路的影响。方法:使用气相色谱法检测盲肠内容物中的SCFAs浓度;分别使用生化分析仪和鲎试剂对门静脉血液中乙醇和LPS的浓度进行检测;采用RT-PCR和Western blot实验对肝脏中的TLR4、NF-κB p65、PPARγ、SREBP-1c进行核酸和蛋白水平的进行定量;采用ELISA实验检测肝内的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。结果:MP-A可显著地降低门静脉中乙醇和LPS的水平,抑制肝内TLR4和NF-κB p65表达及下游炎症因子的分泌,缓解肝内炎症。同时,气相色谱结果显示,MP-A的干预还可促进肠道内SCFAs的产生,转运至肝脏后可抑制PPRγ和SREBP-1c表达和活性,调节肝内脂质代谢,缓解HFD大鼠肝脏的脂肪变性。结论:MP-A可通过调节“LPS-TLR4-NF-κB”和SCFAs通路,改善和缓解HFD大鼠的NAFLD进程。
【图文】：

图１．１邋ＭＰ－Ａ的结构逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＭＰ－Ａ逡逑

实验设计,血脂康

．１．４．１药物溶液的配制逡逑ＭＰ－Ａ邋（６００ｍｇ／ｋｇ）溶液：称取４．８ｇＭＰ－Ａ，加蒸馏水溶解至４０ｍＬ，浓度逡逑为１２０邋ｍｇ／ｍＬ。其他剂量组的溶液依次按比例稀释得到。逡逑血脂康（２１６邋ｍｇ／ｋｇ）溶液：取４粒血脂康于研钵中进行研磨，，然后加蒸馏逡逑水混悬至２７．６邋ｍＬ，浓度为０．０４３邋ｇ／ｍＬ。逡逑１．４．２动物分组逡逑将３６只ＳＤ雄大鼠通过简单随机化分成６组：正常组、ＨＦＤ组、血脂康组、逡逑ＭＰ－Ａ邋（１００ｍｇ／ｋｇ）组、ＭＰ－Ａ邋（３００ｍｇ／ｋｇ）组、ＭＰ－Ａ邋（６００ｍｇ／ｋｇ）组，每组逡逑６只。逡逑１．４．３实验过程逡逑Ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285

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