益肾骨康方抑制骨癌痛的作用机制及成药性研究

发布时间：2020-03-19 20:20

【摘要】：骨癌痛是晚期癌痛患者最常见的疼痛形式,主要由于肿瘤侵犯骨骼及神经,或瘤体压迫神经、病理性骨折及部分抗肿瘤治疗等原因所致,其分子机制尚不清楚。目前普遍认为,骨癌痛的发生可能与肿瘤细胞和炎症细胞产生的致痛介质、破骨细胞的持续激活活化以及肿瘤扩张引起的神经压迫和损伤有关,其中脊髓p38MAPK信号通路的激活在骨癌痛发病机制中地位越来越重要。临床主要应用阿片类药物治疗,辅助放疗、化疗、热疗等手段联合治疗。由于西医治疗手段具有一定副作用,临床中很多癌痛患者疼痛不能得到有效控制,严重影响了其生存质量。中医药治疗癌性疼痛手段丰富,副作用小,安全有效,且能缓解西医治疗带来的副作用,在治疗癌痛方面具有一定优势。益肾骨康方是导师冯利教授的专利处方,在多个临床研究中已证实其治疗癌性疼痛的有效性及安全性,并且可以减少阿片类药物用量,减少癌痛患者爆发痛次数,但其抑制骨癌痛的分子机制尚不清楚。课题组前期研究发现,在裸鼠肺癌骨转移模型中,益肾骨康方可以降低骨转移发生率,并且具有促进体外成骨的作用。本研究在前期研究基础上,将益肾骨康方开发成中成药颗粒制剂,既可方便患者服用及携带,又有较好的质量控制。同时通过观察益肾骨康方对骨癌痛模型大鼠疼痛行为学的影响,揭示其抑制骨癌痛的分子机制,可为开发癌痛的新型治疗药物提供理论基础。研究目的1.进行益肾骨康方的成药性研究,获得更科学更稳定,方便患者服用的剂型,为今后临床制剂的研究打下基础。2.通过观察益肾骨康方对骨癌痛模型大鼠的治疗作用,探讨益肾骨康方抑制骨癌痛的分子机制,为中医药抗癌痛提供新思路新方法。研究方法(一)益肾骨康方的成药性研究:根据益肾骨康方组方药物有效成份分析,对药材吸水率进行考察,并以野黄芩苷转移率为考察指标,进行提取正交实验、对比实验、放大验证实验,确定其提取工艺;对辅料配比进行考察,确定成型工艺;采用薄层鉴别的方法进行药材质量鉴定,对制剂进行微生物度、重金属、砷剂、浸出物检测。(二)益肾骨康方抑制骨癌痛的机制研究:1.建立大鼠骨癌痛模型,并观察益肾骨康方对骨癌痛模型大鼠疼痛行为学的影响。选取体重为(200±20)g的雌性Wistar大鼠随机分为假手术组及造模组,采用Walker256乳腺癌细胞并通过腹水传代的方式,将得到的腹水瘤细胞种植到大鼠左后肢胫骨骨髓腔内,假手术组注射生理盐水。通过影像学及行为学进行评估,待模型成功后(造模后第14天)将大鼠随机分为假手术组、模型组、益肾骨康方低剂量组、中剂量组、高剂量组及盐酸曲马多阳性对照组,每组各10只,药物干预14天。观察造模前及造模后第4、7、10、14、21、28天各组大鼠体重、机械性痛阈值、热痛阈值、双后肢负重差。观察模型组造模后第7、14、21、28天胫骨X线变化,并于造模后第28天,对各组大鼠胫骨组织进行HE染色,观察益肾骨康方对各组大鼠骨组织的影响。2.观察益肾骨康方对骨癌痛模型大鼠脊髓背角p38MAPK信号通路关键分子及相关炎症分子的影响:采用RT-PCR的方法检测各组大鼠脊髓背角p38MAPK、IL-1β、TNF-α、COX-2mRNA的含量,采用Western blot方法检测大鼠脊髓背角p38MAPK、p-p38MAPK蛋白含量;采用免疫组化的方法观察各组大鼠脊髓背角p38MAPK的表达情况并分析各阳性蛋白的MOD值;采用ELISA法检测各组大鼠外周血中TNF-α、IL-1β、COX-2、IL-6、PGE2炎症因子的含量。3.观察益肾骨康方对骨癌痛模型大鼠OPG/RANK/RANKL信号通路的影响。采用免疫组化的方法检测各组大鼠胫骨中OPG、RANK、RANKL蛋白的表达情况,统计各阳性蛋白的MOD值。研究结果(一)益肾骨康方的成药性研究:根据益肾骨康方各药物有效成分的特点,采用水提工艺,经计算药材的吸水率为200%,以野黄芩苷的转移率为考察指标,并进行正交试验、对比实验、放大及验证试验,确定提取工艺为加水煎煮3次,三次加水量分别为10倍、8倍、8倍,每次煎煮1.5h。经制粒考察,确定底料为糊精与甘露醇(8:1)的混合物,底料和干膏的比例为1:2。所煎药夜经滤过、浓缩,采用一步制粒法即得。对处方药物进行薄层鉴定分析,制定质量控制标准。对所得颗粒剂进行微生物度、重金属、砷剂、浸出物检测,均符合2015年版《中国药典》相关规定。(二)益肾骨康方抑制骨癌痛的机制研究:1.益肾骨康方对骨癌痛模型大鼠疼痛行为学的影响:体重方面,造模后第28天,模型组大鼠体重低于假手术组(p0.05),益肾骨康方各组及盐酸曲马多阳性药组体重均高于模型组(p0.05);机械性痛阈值方面,各组大鼠在造模后第4天机械性痛阈值较造模前略降低,随后假手术组机械性痛阈值逐渐回升至正常,而造模各组继续降低,造模14天之后,模型组机械性痛阈值降低至9以下并逐渐趋于稳定。造模第21、28天,益肾骨康方各组及阳性药组大鼠机械性痛阈值高于模型组(p0.05),且中剂量组与盐酸曲马多阳性药组比较无显著统计学差异(p0.05);在热痛阈值方面,造模后第4天各组大鼠热痛阈值略有下降,之后假手术组热痛阈值逐渐恢复至正常,而造模各组热痛阈值继续降低。造模后第10天开始,造模各组大鼠热痛阈值显著低于假手术组(p0.05),造模第14天之后,模型组大鼠热痛阈值稳定在5以下;造模后第21天及28天,中剂量组、阳性药组大鼠热痛阈值显著高于模型组(p0.05),且中剂量组和盐酸曲马多阳性药组比较无统计学差异(p0.05);双后肢负重差方面,各组大鼠在造模后第4天双后肢负重差值较造模前略增大,10天后假手术组双后肢负重差值逐渐恢复正常,而造模各组负重差值逐渐增大。造模后第7天开始,造模各组大鼠后肢负重差高于假手术组(p0.05);造模后第21、28天,益肾骨康方各组及盐酸曲马多阳性药组负重差均小于模型组(p0.05);造模后第21天,中剂量、高剂量组负重差值显著低于盐酸曲马多阳性药组(p0.05),造模后第28天,益肾骨康方各组均小于盐酸曲马多阳性药组(p0.05);X线及HE染色结果可见,模型组大鼠第14天术肢胫骨X线检查可见骨质破坏,并随时间呈进行性加重。各组大鼠胫骨HE染色可见模型组及阳性药组骨组织破坏严重,益肾骨康方各组较模型组及阳性药组轻,其中中剂量组骨破坏最轻。2.益肾骨康方对骨癌痛模型大鼠脊髓背角p38MAPK信号通路及相关炎症分子的影响:RT-PCR结果显示,模型组大鼠脊髓背角p38MAPK、TNF-α、COX-2、IL-1βmRNA含量显著高于假手术组(p0.05),益肾骨康方中剂量组、高剂量组可显著降低骨癌痛模型大鼠脊髓背角p38MAPK、TNF-α、COX-2mRNA含量(p0.05),益肾骨康方各组均显著降低IL-1βmRNA含量(p0.05);Western blot结果显示,模型组大鼠p38MAPK、p-p38MAPK蛋白含量均显著高于假手术组(p0.05),益肾骨康方中剂量、高剂量组可显著降低骨癌痛模型大鼠脊髓p38MAPK蛋白含量(p0.05),益肾骨康方各组均可显著降低p-p38MAPK蛋白含量(p0.05)。免疫组化结果显示,模型组大鼠脊髓背角p38MAPK蛋白表达强于假手术组(p0.05),益肾骨康方各组均可显著下调大鼠脊髓背角p38MAPK蛋白表达(p0.05),其中中剂量效果最好。ELISA结果显示,模型组大鼠外周血TNF-α、IL-6、PGE2、IL-1β、COX-2含量显著高于假手术组(p0.05),益肾骨康方各组可显著减低骨癌痛模型大鼠血清TNF-α、IL-6、PGE2含量(p0.05),中剂量组、高剂量组可显著降低IL-1β、COX-2含量(p0.05)。3.益肾骨康方对骨癌痛模型大鼠OPG/RANK/RANKL信号通路的影响:免疫组化结果显示,模型组OPG蛋白表达低于假手术组(p0.05),RANK、RANKL蛋白高于假手术组(p0.05);与模型组比较,益肾骨康方各组均可显著上调骨癌痛模型大鼠胫骨OPG蛋白表达(p0.05),下调RANKL表达(p0.05),中剂量组及高剂量组可显著下调RANK表达(p0.05)。研究结论1.益肾骨康方颗粒制剂工艺路线明确,质量控制符合2015年版《中国药典》相关规定;2.益肾骨康方可有效抑制骨癌痛大鼠疼痛症状,减轻骨质破坏,其中中剂量组效果最好;3.益肾骨康方可能通过调控p38MAPK信号通路及抑制相关炎症分子达到抑制骨癌痛的作用;4.益肾骨康方可能通过调控OPG/RANK/RANKL信号通路,抑制破骨细胞活化,减轻骨质破坏进而减轻骨癌痛。
【图文】：

逦Ｏｓｔｅｏｃｙｔｅｓ逡逑图２溶骨性骨转移和成骨性骨转移的“恶性循环”示意图逡逑图２示：溶骨性骨转移：一方面肿瘤细胞（以乳腺癌细胞为例）迁移至骨组逡逑织，分泌ＥＧＦ，邋ＯＳＦ，邋ＴＮＦｓ及活化素Ａ等破骨细胞刺激因子；肿瘤细胞还可以逡逑分泌ＲＡＮＫＬ，邋Ｍ－ＣＳＦ，邋ＩＬ－１，邋ＩＬ－６，邋ＩＬ－１１等破骨细胞分化因子，促进破骨前体逡逑细胞向破骨细胞转化；另一方面，发生骨吸收时，骨甚质释放大量的生长因子如逡逑ＴＧＦ－ｐ，邋１ＧＦ－１，邋ＢＭＰｓ，邋ＰＤＧＦ等促进肿瘤细胞的生长。此外，骨细胞在此过程逡逑中可以分泌大量的Ｓ０ＳＴ邋（尤其是多发性骨髓瘤）抑制成骨细胞活性及逡逑Ｗｎｔ／ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ蛋白表达。成背性甘转移：一方＿ｌｉｌｆ肿瘤细胞（以前列腺癌细胞为例）逡逑迁移至骨组织，分泌邋ＴＮＦ－ａ，ＩＧＦ－ｌ，邋ＷＮＴ１，邋ＷＮＴ３Ａ，邋ＥＴ－１，邋ＢＭＰｓ，邋ＰＴＨｒＰ逡逑以及肾卜＿腺髓质素等成骨细胞刺激因子，增加成骨细胞分化及活化；成骨细胞激逡逑活后培力［１ＲＡＮＫＬ，邋Ｍ－ＣＳＦ的表达，启动成骨细胞介导破骨细胞活化，进入骨吸逡逑收过程。另一方面成骨细胞可以分泌大量的ＧＦｓ

逦Ｏｓｔｅｏｃｙｔｅｓ逡逑图３骨癌痛的分子机制图逡逑图３示：由于低氧及其他因素，肿瘤细胞在骨髓微环境中的糖酵解代谢增强，为逡逑维持胞内ＰＨ稳定，向周围环境释放大量的乳酸及Ｈ＇肿瘤细胞还可以促进破骨逡逑细胞分化及活化，破骨细胞以空泡－ＡＴＰ酶形式将Ｈ＋释放到溶解的骨间隙内。由逡逑于破骨细胞不正确的凋亡，Ｈ＋被释放到骨髓微环境中。Ｈ＋可瞬间激活起神经元逡逑上的酸感离子通道３（ａｃｉｄ邋ｓｅｎｓｉｎｇ邋ｉｏｎ邋ｃｈａｎｎｅｌｓ邋－３，邋ＡＳＩＣ－３），辣椒素受体ｌ（ＴＲＰＶ－ｌ）逡逑等，引起疼痛反应。肿瘤引起微骨折时，一般认为骨细胞可通过释放Ｈ＋直接刺逡逑激痛觉感受器引起痛觉。肿瘤细胞可以分泌许多细胞因子来激活痛觉感受器。如逡逑ＮＧＦ可以与神经元上的ＴｒｋＡ－ｐ７５受体结合。肿瘤细胞还可以通过ＩＬ－１（３、ＭＣＰ－１逡逑激活神经元上ＡＳＩＣ－３、ＴＲＰＶ－１通道，并可以激活和趋化巨噬细胞。巨V 细胞可逡逑以通过自分泌进一步释放ＩＬ－１（３、ＭＣＰ－］、ＴＮＦ－ａ，引起组织细胞凋亡。由于免疫逡逑应答增强、活性氧生成、肿瘤释放细胞毒等多种因素
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285

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本文编号：2590670