温阳活血利水法对嘌呤霉素损伤的足细胞发动蛋白（dynamin）表达的影响

发布时间：2020-03-21 01:34

【摘要】：目的:观察温阳活血利水法对氨基核苷嘌呤霉素损伤的小鼠永生性足细胞发动蛋白(Dynamin)表达的影响,探讨温阳活血利水方降低尿蛋白的作用机制。方法:1.制备温阳活血利水方的中药含药血清。2.细胞培养、传代和诱导分化成熟的足细胞,用浓度为45mg/L的嘌呤霉素损伤足细胞,并用温阳活血利水方中药血清进行干预,以糖皮质激素地塞米松干预作为阳性对照,并设正常对照和中药空白对照,分组如下:A:正常对照组、B:嘌呤霉素(45mg/L)组/模型组、C:地塞米松(1μmol/L)组、D:10%的中药血清组、E:20%的中药血清组、F:中药血清空白对照组。3.实时定量PCR检测各组足细胞组织蛋白酶(Cat L)m RNA和足细胞发动蛋白(dynamin)m RNA的相对表达量。4.Western blot检测各组足细胞组织蛋白酶(Cat L)和足细胞发动蛋白(dynamin)的蛋白表达。5.免疫荧光染色结合激光共聚焦技术观察温阳活血利水中药方对嘌呤霉素造成的足细胞损伤模型中足细胞细胞骨架结构微丝(microfilaments)、微管(microtubule)的形态结构变化以及足细胞组织蛋白酶(Cat L)和足细胞发动蛋白(dynamin)的表达变化。结果:1.RT-PCR实验显示:模型组的CatL m RNA表达含量比正常组高(P0.01);与模型组比较,中药组与地塞米松组Cat L m RNA表达含量降低(均P0.01);10%与20%中药组与地塞米松组相比,Cat L m RNA无差异(P0.01);10%中药组Cat L m RNA表达较20%中药组高(P0.01);实验中6个分组足细胞Dynamin m RNA相对表达量无组间差异(P0.01)。2.免疫荧光显示:与正常组比较,模型组的Cat L荧光强度增强,Dynamin荧光强度减弱;与模型组比较,中药血清组和地塞米松组Cat L蛋白荧光减弱,而Dynamin荧光增强。3.Western blot显示:与正常组比较,模型组的Cat L表达升高,Dynamin表达降低(均P0.01);与模型组比较,中药组和地塞米松组Cat L表达降低,Dynamin表达升高(均P0.01);与地塞米松组比较,两中药组Cat L表达无差异(P0.01),而10%中药组Dynamin表达较低,20%中药组Dynamin表达较高(均P0.01);两中药组之间比较,10%中药组Cat L表达较高,Dynamin表达较低(均P0.01);中药血清空白对照组与正常组比较,Cat L与Dynamin均无差异(P0.01)。4.微丝、微管的免疫荧光结果:与正常组比较,模型组细胞胞体缩小、伪足回缩,细胞骨架结构微丝形成的张力纤维出现了由协调有序的平行排列模式重组变成了紊乱无序的放射网状结构、微丝数量减少,并且趋于边缘化形成核外环,与此同时细胞骨架结构微管出现了数量减少、解聚、排列紊乱,但在足细胞初级突起处分布数量有所增加;在中药血清组和地塞米松组均可以观察到足细胞形态、骨架蛋白结构有所改善。结论:温阳活血利水方中药血清会使嘌呤霉素诱导的小鼠永生化足细胞损伤模型中足细胞组织蛋白酶Cat L表达减少,足细胞发动蛋白Dynamin含量增加,但Dynamin基因的相对表达量无明显改变,并纠正细胞肌动蛋白的骨架重构和微管的排列紊乱。温阳活血利水法可能是通过下调足细胞Cat L的表达而减少Cat L对足细胞Dynamin的裂解,从而稳定细胞骨架中的微丝、微管等结构,维持足细胞的形态,减少足突融合以使蛋白尿得以改善。
【图文】：

. 氨基核苷嘌呤霉素对足细胞微丝、微管的作用以及温阳活血利响肾小球足细胞高度分化，是肾脏滤过装置的重要组成部分。细胞骨架是其保持动态细胞结构的基础，在适当的足细胞功能中要作用。细胞骨架主要有三种结构，微丝、微管和中间丝，它们、彼此依赖，共同构成细胞的支架结构，对细胞内外的各种细胞胞分裂、细胞迁移、细胞内物质运输、细胞粘附等）调控均有重足细胞中这三种结构的分布是：细胞胞体和初级突起内的骨架结(microtubule)和中间丝(intermediate filaments)为主，次级滤过膜的组成结构之一，习惯直接称之为足突）的骨架结构则icrofilament)为主[34]。

图 2：微管、中间丝、微丝之间联系肾小球的足细胞暴露于血液滤过压力之中，其与基底膜的有效连接对维持滤过功能至关重要，粘着斑是足细胞与基底膜连接和细胞外环境作用的必要结构之一。对胃癌细胞的新近研究表明，粘着斑激酶与细胞的微管、微丝分布有关，可见微丝、微管与粘着斑存在某种关联[43]。另外，一项对足细胞发动蛋白 Dynamin 的研究显示，Dynamin 与微管存在某种关联，Dynamin 的缺失会导致微管蛋白乙酰化水平急剧增加[23]。结合本次实验中温阳活血利水方对损伤足细胞微管的修复以及对 Dynamin 的保护作用，我们推测该中药方可以通过降低损伤足细胞中 CatL 的表达，，减少 CatL 对Dynamin 的裂解，减少因 dynamin 缺失造成的微管蛋白的破坏，从而保护dynamin 与微丝结构的良性互动，修复损伤足细胞中微丝、微管结构，保护粘着斑结构功能的完整，从而使足细胞稳定地附着于基底膜，维持肾小
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】

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本文编号：2592523