姜黄素类似物WZ26抗胆管癌作用及机制研究

发布时间：2020-03-21 17:00

【摘要】：目的:胆管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是一种常见的胆道恶性肿瘤,恶性程度高,预后极差,约占消化道肿瘤中的3%,其发病率与死亡率逐年上升。目前胆管癌治疗原则仍采用手术切除为主的综合治疗方案,但确诊时仅有不足1/3的患者可行手术切除,且手术预后差,联合化疗对局部晚期或转移性不可切除胆管癌效果也不理想,迫切需要开发新的多学科综合治疗手段和治疗药物,从而改善胆管癌患者的预后。姜黄素,中药姜黄中提取的天然成分,具有抗肿瘤、抗氧化和抗炎等多种生物活性,但是由于其化学不稳定及生物利用度低等缺点,限制了其临床应用。本论文通过对姜黄素的不稳定基团改造,得到了化学性质稳定的单羰基姜黄素类似物WZ26,并对WZ26进行了初步的抗胆管癌药理活性筛选,发现WZ26显示出很好的抗胆管癌活性。因此本论文将进一步深入的研究WZ26的体内外抗胆管癌的作用及机制。方法:1、姜黄素类似物WZ26的体外抗肿瘤活性及机制研究以姜黄素为先导化合物,设计合成了结构稳定的单羰基姜黄素类似物WZ26,通过MTT法测定了化合物WZ26在三种不同胆管癌细胞株中的抗肿瘤活性,通过流式细胞仪研究了化合物WZ26在胆管癌细胞周期阻滞和诱导凋亡中的作用。通过Western-blotting法研究了WZ26对凋亡、周期相关蛋白Pro-caspase3、CDC和Cyclin B1的影响。通过Western-blotting、流式细胞仪和透射电镜等方法,研究了WZ26对胆管癌细胞周期阻滞和诱导凋亡的作用是否与细胞内活性氧(ROS)水平有关。另外,还通过Western-blotting、侵袭和迁移等实验方法,探讨了WZ26抗胆管癌细胞高侵袭性的机制。2、姜黄素类似物WZ26的体内抗肿瘤活性及机制研究通过建立胆管细胞癌QBC-939细胞株的BALB/c A裸鼠皮下瘤模型,运用Western-blotting、免疫组化、免疫荧光等手段来验证化合物WZ26体内抗肿瘤药理药效及初步探讨其作用机制。结果:一、姜黄素类似物WZ26的体外抗肿瘤活性及机制研究1、WZ26对胆管癌细胞(RBE、QBC-939、HUCCA)的半数抑制率IC50都较姜黄素小,即WZ26对胆管癌细胞生长的抑制活性较姜黄素好。2、WZ26剂量(5,10,20μM)依赖性地促进胆管癌细胞株(RBE、QBC-939、HUCCA)凋亡,同时也诱导胆管癌细胞周期阻滞在G2/M期。3、机制上WZ26通过升高QBC-939细胞内活性氧(ROS)水平,可以诱导细胞凋亡和周期阻滞,而ROS抑制剂NAC可以逆转以上改变。4、通过JC-1免疫荧光方法,观测到化合物WZ26加入后,由于线粒体膜电位的衰竭,荧光由红色变成绿色。电镜观测线粒体的形态学,看到WZ26作用后QBC-939细胞线粒体内膜脊结构发生破坏导致线粒体肿胀,在超微结构上证明线粒体膜发生破坏。5、用免疫荧光法检测QBC-939细胞中细胞色素C由线粒体释放到细胞质情况。结果显示在WZ26(15μM)处理细胞24h后,细胞色素C从线粒体中释放到细胞质中,红色荧光从绿色荧光中扩散出来。WZ26(15μM)处理24h后Caspase9的活性也明显增加。6、Western blottingting结果显示WZ26作用于QBC-939细胞后时间和剂量依赖性抑制了STAT3的激活。7、划痕实验,Transwell,PCR和Western blottingting结果说明WZ26可以抑制TNF-α诱导的QBC-939细胞的迁移、浸润和抑制TNF-α诱导的QBC-939细胞的上皮间质转化。8、Western blottingting结果显示WZ26还可抑制QBC-939细胞内TNF-α和LPS诱导的STAT3通路的激活。二、姜黄素类似物WZ26的体内抗肿瘤活性及机制研究研究结果发现WZ26通过升高肿瘤组织内活性氧水平,诱导线粒体损伤和细胞凋亡,明显抑制小鼠QBC-939细胞皮下瘤生长。1、从体重和肿瘤数据可以看到,给药组和对照组裸鼠的体重没有明显的差异,说明药物对裸鼠基本无毒。从肿瘤体积图中可以明显看到,裸鼠给药WZ26后,肿瘤体积减小,说明WZ26能够抑制胆管癌QBC-939细胞生长。2、从Western blottingting结果可以看到,在肿瘤组织中促凋亡蛋白Cleaved-caspase3表达增加,说明WZ26在体内也能够促进胆管癌QBC-939细胞的凋亡。3、从免疫组化结果可以看到,与增殖相关的蛋白Ki67在给药组表达减少,说明WZ26抑制了裸鼠体内胆管癌QBC-939细胞的增殖。结论:本文通过对WZ26的体内外抗胆管癌的作用及机制研究发现,WZ26一方面通过升高胆管癌细胞中的氧化应激水平,从而激活线粒体凋亡通路来诱导细胞凋亡并阻滞细胞周期;另一方面通过抑制STAT3的磷酸化,抑制胆管癌细胞侵袭、迁移和上皮间质转化(EMT)从而发挥抗胆管癌的作用。WZ26很有潜力成为胆管癌治疗中的新一类候选药物。同时,我们的研究也表明,靶向ROS水平和抑制炎症因子的表达有可能成为治疗胆管癌的重要策略。但是目前对该化合物作用靶点以及深入的抗胆管癌机制没有十分明确,有待于进一步探讨。
【图文】：

3.1 WZ26 的结构和抑制胆管癌细胞的生存率通过对姜黄素的结构改造，去除其不稳定基团，我们得到姜黄素单羰基类似物WZ26，其化学结构如图 3-1A。以姜黄素为阳性对照，用 MTT 法检测了 WZ26 对三种胆管癌细胞（RBE，QBC-939，HUCCA）生存率的影响。WZ26（浓度为 0.625，1.25，2.5，5，10，20μM）孵育胆管癌细胞 24 小时，实验结果显示 WZ26 可以剂量依赖性地降低胆管癌细胞的生存率，其中对测定的 RBE，QBC-939 和 HUCCA 细胞的 IC50 值分别为 4.7μM，4.8μM 和 4.2μM, 姜黄素对应 IC50 值分别为＞20μM，8.9μM和 10.8μM（图 3-1-B-C）。这表明 WZ26 明显抑制胆管癌细胞的生存率，作用效果要优于姜黄素。同时，我们用 MTT 实验对 WZ26 的毒性做了评估，WZ26 对正常胆管上皮细胞（HIBEC）的 IC50 值＞20μM（图 3-1-B），这进一步表明 WZ26 可以选择性的抑制胆管癌细胞的生存率，对正常细胞影响较小，安全性高。

WZ26诱导胆管癌细胞凋亡和周期阻滞A.WZ26（5，，10和15μM）分别处理胆管癌细胞RBE，QBC-939，HUCCA细胞24HUCCAQBC-939
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

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本文编号：2593646