桑树黄酮苷芦丁的定向糖基改造生物催化研究

发布时间：2020-03-21 18:30

【摘要】：桑树黄酮主要以糖苷形式存在,具有抗氧化、降血压等多种生物活性,是当前蚕桑资源利用的研究热点之一。然而,桑树黄酮苷的生物活性与其糖基的种类与组成密切相关,对其开展糖基定向改造的生物催化研究有望提高其活性、稳定性及生物利用度。本文以α-L-鼠李糖苷酶(rhaB1)催化芦丁的鼠李糖基定向水解制备异槲皮苷为模式体系,率先应用双启动子表达载体制备绿色荧光蛋白标记的示踪催化剂,设计中空纤维膜反应器和液滴微反应器强化其生物转化过程。主要研究内容如下:(1)利用双启动子表达载体pRSFDuet1构建重组Escherichia coli BL21-pRSFDuet1-rhaB1-EGFP,分析rhaB1-EGFP的酶学性质及其表达量与荧光强度之间的相关性。结果表明:以四硝基甲苯-α-L-吡喃鼠李糖苷(pNPR)为底物测定酶活,rhaB1-EGFP粗酶液的最适温度为40℃,比课题组前期利用pET21a载体在E.coli BL21(DE3)中表达的rhaB1粗酶液降低了5℃,最适pH均为6.5。rhaB1-EGFP在40℃处理30 min后相对活力剩余95%,rhaB1在45℃下处理30 min后仅剩80%。rhaB1-EGFP的蛋白表达量与EGFP的荧光强度关系可以用方程Y=-3.1077×10~(-5)X2+0.03577X-1.82628表示,通过测量荧光强度即可计算rhaB1-EGFP的表达量。(2)分别以rhaB1-EGFP的粗酶液和全细胞为催化剂,考察其催化水解芦丁制备异槲皮苷的工艺条件,并利用表面等离子共振(SPR)分析rhaB1以及rhaB1-EGFP对芦丁的亲和力。结果表明,粗酶液的最适催化温度为40℃、最适pH为6.5、最适底物浓度为0.03 g/L,在此条件下反应10 h产物最大得率为91.7±2.4%;全细胞最适催化温度为40℃、最适pH为6.0、最适底物浓度为0.05g/L,在此条件下反应2 h产物最大得率为92.5±4.8%;rhaB1-EGFP和rhaB1与芦丁的平衡解离常数分别为8.7×10-6 mol·L-1和5.8×10-6 mol·L~(-1),差异不显著(P0.05),表明两种酶均能与底物高特异性结合。(3)以重组E.coli全细胞为催化剂构建反应分离耦合的聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜细胞反应器,考察萃取剂与底物体积比、反应温度、pH、底物浓度对酶促水解芦丁生成异槲皮苷的影响以及催化剂的重复利用度。结果表明,萃取剂与底物比为1:2时实现反应分离耦合后产物的得率提高了1.8倍,优化膜反应器的工艺条件为:萃取剂:底物=3:4、温度为40℃、pH为5.5、底物浓度为0.02g/L,反应6 h产物最大得率为87.9±2.9%。利用1%(v/v)的HCl水溶液清洗反应10 h的膜组件7次,膜通量可恢复75%。全细胞催化剂重复使用5次,相对酶活力仍然保持50%以上。(4)以rhaB1粗酶液为催化剂构建W/O型液滴微反应器,考察分散相和连续相压力对液滴大小的影响,并对液滴微反应器中酶催化水解芦丁生成异槲皮苷的反应条件进行优化。结果表明,选择流动聚焦型芯片(22.5 mm×15 mm,通道内径300μm),分散相与连续相压力均为100 mbar时,形成的液滴最小,直径为67.2±12.9μm;分散相与连续相压力分别为150 mbar和125 mbar时,形成液滴最大,直径为1485.25±46.41μm。经单因素和响应曲面法优化液滴微反应器内酶催化工艺的最佳条件为:温度为35℃、底物浓度为0.02 g/L,pH为5.5,此条件下产物的时空产率高达75.54μg/m_3/d。综上所述,本文成功制备了荧光标记的α-L-鼠李糖苷酶rhaB1-EGFP,与芦丁结合具有与rhaB1无差异性的亲和力。构建的PVDF膜细胞反应器与液滴微反应器成功实现了高效的生物催化,为桑树黄酮苷的糖基定向改造提供了新的思路和方法。
【图文】：

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也可降低肝脏中锌、铜等金属离子浓度或抑制造成肝脏组织损坏的酶活性从而保护肝皮素可以抑制涉及各种炎症细胞因子表达的转录因子 NF-kappaB 的产生，从而或减少炎症的发生[4]，还可以抑制血管内皮生长因子的生成、激活滑膜细胞端粒时促进血管内皮细胞增殖和迁移的生长因子的生成，进而预防血管翳的形成。异苷能够增强胰高血糖素样肽 1 的分泌，从而调节胰岛素的分泌[5]，因此异槲皮苷用于调节葡萄糖的稳态。此外，黄酮还具有抗氧化的作用，可有效抑制和清除人产生的活性氧和自由基；具有抗真菌活性，可用作抗菌剂；具有抗病毒活性，如素、儿茶素和橙皮苷；对骨质疏松、肿瘤等也具有一定的抑制作用。1.3 桑树黄酮的提取制备桑树黄酮的传统提取方法主要有索氏提取、水蒸气蒸馏、溶剂提取等，存在一限制，如萃取时间较长，对溶剂纯度、萃取剂选择性要求较高，导致成本高，同量的溶剂蒸发产生的三废治理也加剧了工艺成本。为了克服这些问题并满足不同的需求，更多非常规的技术被开发和应用（见图 1.1）。

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江苏科技大学农学硕士学位论文持较大的膜通量以持续利用显得尤为重要。膜污染是由多种原因引起、非常复杂的现象，混合物中絮凝物、胶体及溶质的大小都会影响膜的过滤系统。如果污垢与膜孔大小相当，或比膜孔小，则可能发生孔壁上的吸附和孔堵塞；而当污垢比膜孔大时，则可能在膜表面形成滤饼层，进而阻碍膜分离过程。如图 1.2 所示，，膜反应器中污垢的形成及去除过程比较复杂。通常，污垢由松散附着的杂质引起，大多情况下通过反洗等物理清洗可以去除，而对于由过滤过程中膜孔堵塞和强附着杂质则需要化学清洁方法才能去除。一旦形成不可逆污垢，便是永久性污垢，难以将其清除，导致膜的无法使用。因此，为了延长膜的使用效率，需对膜反应器进行定期清洗。
【学位授予单位】：江苏科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284

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