广藿香醇胃液代谢物β-广藿香烯抗胃溃疡及溃疡性结肠炎的研究

发布时间：2020-03-22 14:07

【摘要】：目的:广藿香属于药食同源,既是藿香正气液(胶囊)、藿胆丸等40多种中成药制剂的重要药味,也是饮料、糖果、烘焙产品以及功能性食品中的常见植物成分,故其在市场上占有重要份额,极具开发潜力,提高和控制其药材及挥发油的质量显得格外重要。广藿香是传统中医防治消化系统疾病的芳香化湿要药,其研究重点在于探讨挥发性成分的胃肠调节作用。广藿香醇、广藿香酮和β-广藿香烯是广藿香中含量较高的芳香成分,现代研究已阐明广藿香醇和广藿香酮是广藿香“芳香化浊,开胃止呕”的药效物质基础,具有抗胃溃疡及溃疡性结肠炎的作用,其中广藿香醇更是我国国家和地方广藿香药材及其挥发油质量分析鉴定的标准指标成分。但广藿香药材及其挥发油都是混合物,成分众多,仅以广藿香醇作为指标成分控制药材及挥发油的质量明显不足,故有必要引入其他广藿香药效物质基础成分形成指标成分群,提高质量标准,严格控制市场上药材和挥发油的质量。因此,探究广藿香中的药效物质基础成分十分必要。当前广藿香的胃肠保护活性研究集于广藿香醇和广藿香酮,而对β-广藿香烯等其他含量较多成分缺乏研究。β-广藿香烯与广藿香醇结构相似,研究发现广藿香醇在酸性条件下会反应生成β-广藿香烯,而胃液正是酸性溶液,那么广藿香醇在胃液中代谢是否会转化为β-广藿香烯,迄今尚未报道。若β-广藿香烯是广藿香醇在胃部的代谢物,是否跟广藿香醇相似也具有防治胃溃疡及溃疡性结肠炎的活性,作用机制如何,迄今也未见相关报道。若β-广藿香烯具有抗胃溃疡及溃疡性结肠炎的作用,而其又是广藿香中含量较高的芳香性成分之一,无疑可作为广藿香的药效物质基础,为广藿香防治胃肠疾患提供科学依据。同时,β-广藿香烯还可与广藿香醇、广藿香酮形成指标成分群,用于提高和控制广藿香药材和挥发油的质量,有利于广藿香药材市场的健康发展。因此,开展β-广藿香烯的抗胃溃疡及溃疡性结肠炎的作用研究具有重要意义。本课题拟通过体内外胃液代谢模型,考察广藿香醇在胃液的代谢情况,探讨广藿香醇转化为β-广藿香烯的作用机理。其次,通过体外乙醇诱导的GES-1胃上皮细胞损伤模型,以及体内无水乙醇和吲哚美辛诱导的大鼠急性胃溃疡模型探讨β-广藿香烯抗胃溃疡的作用及相关机理;同时通过体外LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型,以及体内DSS诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎模型,探讨β-广藿香烯抗溃疡性结肠炎的作用及相关机理。方法:1.广藿香醇的胃液代谢研究建立体内外胃液代谢模型,用GC7890A-MSD5975C气质联用仪分析广藿香醇的代谢物。采用HP-5MS 5%Phenyl Methyl Silox毛细管气相色谱柱(30 m×250μm×0.25μm),设置250℃进样温度,1.3 mL/min流速,60:1分流比。离子源采用EI,能量70eV,温度230℃,四级杆温度150℃,m/z范围35~400,全扫描模式。采用以下程序升温:50℃保持2 min,以60℃/min速率升温至120℃,保持5 min,再以10℃/min速率升温至150 ~oC,接着以60℃/min速率升温至235℃,保持15 min。2.β-广藿香烯抗胃溃疡的作用研究体外研究采用乙醇诱导的GES-1胃上皮细胞损伤模型,通过MTT法检测β-广藿香烯干预后GES-1胃上皮细胞的细胞活力,评价β-广藿香烯对乙醇诱导的GES-1胃上皮细胞损伤的保护作用。体内研究采用无水乙醇和吲哚美辛诱导的大鼠急性胃溃疡模型,灌胃β-广藿香烯,检测胃液pH、胃黏膜溃疡面积和抑制率,HE染色观察组织形态且评分,评价β-广藿香烯对无水乙醇和吲哚美辛致大鼠胃溃疡的保护作用。通过测定SOD、GSH、CAT和MDA的含量,ELISA法测定TNF-α、IL-1β和IL-6的水平,免疫组化法测定Fas、FasL和caspase-3的蛋白表达,qRT-PCR测定c-fos、c-jun和miR-21的基因表达,Western blot检测p65、IκB和ERK1/2的磷酸化水平,以阐述β-广藿香烯对无水乙醇致大鼠胃溃疡的保护机制。通过测定MPO的含量,ELISA法测定TNF-α、E-selectin、P-selectin、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、VEGF和ET-1的水平,免疫组化法测定COX-1和COX-2的蛋白表达,qRT-PCR测定flt-1和ETAR的基因表达,Western blot检测IκBα和JNK的磷酸化水平及PGE_2的蛋白表达,以阐述β-广藿香烯对吲哚美辛致大鼠胃溃疡的保护机制。3.β-广藿香烯抗溃疡性结肠炎的作用研究体外研究采用LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型,β-广藿香烯给药后,Griess法检测NO的含量,ELISA法检测PGE_2、TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10细胞因子的含量,qRT-PCR检测COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的基因表达,评价β-广藿香烯对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的保护作用。体内研究采用DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型,灌胃β-广藿香烯,记录动物体征,检测胃液pH、结肠长度和脾重,HE染色观察肠组织形态且评分,评价β-广藿香烯对DSS致小鼠溃疡性结肠炎的保护作用。通过测定MPO的含量,ELISA法测定TNF-α、ICAM-1、P-selectin和LBP的水平,TUNEL法测定肠黏膜细胞凋亡情况,qRT-PCR测定occludin和ZO-1的基因表达,Western blot检测ROCK1、TLR4、MyD88的蛋白表达,IκBα和MLC2的磷酸化水平,以及p65的核易位情况,以阐述β-广藿香烯对DSS致小鼠溃疡性结肠炎的保护机制。结果:1.广藿香醇在胃液中的代谢研究体外研究中,广藿香醇在盐酸、人工胃液、大鼠离体胃液中均会代谢为β-广藿香烯。然而广藿香醇在人工胃液和大鼠离体胃液中的转化率没其在盐酸中的高,推测广藿香醇在胃液的代谢可能受胃蛋白酶、黏液、电解质和内在因子等因素的影响。体内研究中,广藿香醇在大鼠内胃液中会代谢为β-广藿香烯,但转化率不高。pH测定发现体内代谢研究中,大鼠胃液pH为1.5~5.5,而体外胃液代谢研究中大鼠离体胃液pH为1.5~2.0,两者存在差异,推测胃液pH是影响广藿香醇在胃液中代谢的重要因素。广藿香醇在不同pH人工胃液中转化率明显不同,pH值越小,其转化率越高。pH大于3.5时,广藿香醇基本不发生转化。2.β-广藿香烯抗胃溃疡的作用研究体外乙醇诱导的GES-1胃上皮细胞损伤模型中,10、20和40μmol/L的β-广藿香烯干预后均能增强GES-1细胞的活细胞数,提高细胞活力,相同剂量下药效优于广藿香醇。体内无水乙醇和吲哚美辛致大鼠急性胃溃疡模型中,10、20和40 mg/kg的β-广藿香烯灌胃给药后均能减少溃疡面积,改善胃组织形态且降低病理评分。相同剂量下,β-广藿香烯比广藿香醇更有效预防无水乙醇诱发的胃溃疡,而不是吲哚美辛诱发的胃溃疡。无水乙醇诱导大鼠胃溃疡模型中胃液pH为2.5左右,广藿香醇给药后在胃液并未发生明显转化;吲哚美辛诱导大鼠胃溃疡模型中胃液pH则为1.5左右,广藿香醇给药后可能在胃液中全部发生转化。保护机制研究结果显示,无水乙醇致大鼠胃溃疡模型中,不同剂量β-广藿香烯灌胃给药后均能升高SOD、GSH和CAT的含量,以及降低MDA含量以抑制氧化应激;能够降低TNF-α、IL-1β和IL-6的水平,以及下调p65与IκB蛋白的磷酸化水平以抑制NF-κB信号通路,减缓炎症反应;能够下调Fas、FasL和caspase-3的蛋白表达,以及上调c-fos、c-jun和miR-21的基因表达和ERK1/2的磷酸化水平以抑制胃黏膜细胞凋亡。吲哚美辛致大鼠胃溃疡模型中,不同剂量β-广藿香烯灌胃给药后均能降低TNF-α、MCP-1、P-selectin、E-selectin、ICAM-1、VCAM-1和MPO的水平,以及下调IκBα和JNK的磷酸化水平以抑制NF-κB与JNK信号通路,减缓炎症反应;能够升高COX-1、COX-2和PGE_2的蛋白表达,促进VEGF和flt-1表达,以及抑制ET-1和ETAR表达以促进血管生成,加速溃疡愈合。3.β-广藿香烯抗溃疡性结肠炎的作用研究体外LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型中,10、20和40μmol/L的β-广藿香烯干预后均能降低PGE_2、NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的水平和升高IL-10的水平,以及下调COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达和上调IL-10的mRNA表达,从而减缓炎症反应。体内DSS致小鼠溃疡性结肠炎模型中,5、10和20 mg/kg的β-广藿香烯灌胃给药后均能改善模型小鼠体重减轻、腹泻、结肠缩短,以及组织缺损、炎性浸润、腺窝脓肿的情况,降低DAI指数。DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎模型中胃液pH为2.0左右,广藿香醇给药后可能大部分在胃液中发生转化,β-广藿香烯与广藿香醇在相同剂量下的药效比较相差较大。保护机制研究结果显示,DSS致小鼠溃疡性结肠炎模型中,不同剂量β-广藿香烯灌胃给药后均能减少肠黏膜细胞的凋亡,降低组织和血清中LBP的含量,上调occludin和ZO-1的mRNA表达,下调ROCK1蛋白的表达以及MLC2的磷酸化水平,以抑制ROCK-MLC信号通路,保护肠黏膜屏障功能;同时能够降低TNF-α、ICAM-1、P-selectin和MPO的水平,下调TLR4和MyD88的蛋白表达,抑制IκBα的磷酸化以及p65亚基的核易位,从而抑制TLR4介导的NF-κB信号通路,调节免疫功能以减缓肠黏膜的损伤。结论:通过体内外胃液代谢实验,发现广藿香醇在胃液中会代谢为β-广藿香烯,其转化率可能与胃液pH、胃蛋白酶、黏液、电解质和内在因子等因素相关,其中胃液pH尤其重要。通过抗胃溃疡活性实验,发现β-广藿香烯可对抗无水乙醇引起的胃溃疡,且药效优于广藿香醇,作用机制与其抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用相关;同时,发现β-广藿香烯可对抗吲哚美辛引起的胃溃疡,药效与广藿香醇相似,作用机制与其抗炎和促血管再生的作用相关。通过抗溃疡性结肠炎活性实验,发现β-广藿香烯可对抗DSS引起的溃疡性结肠炎,且药效强于广藿香醇,作用机制与其调节免疫功能、保护肠黏膜屏障功能的作用相关。实验结果提示β-广藿香烯具有抗胃溃疡及溃疡性结肠炎的作用,是广藿香治疗消化系统疾病的药效物质基础之一,可为今后提升广藿香药材及挥发油的质量标准提供理论依据。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

【参考文献】