淫羊藿素诱导人宫颈癌细胞凋亡及其机制的研究

发布时间：2020-03-22 14:42

【摘要】：宫颈癌主要是由人乳头瘤病毒持续感染引起的癌症,主要包括宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌。虽然早、中期患者通过手术治疗多数预后良好,但晚期和复发患者的治疗效果仍有限,因此急需开发新型治疗方法和药物。近年的研究发现,细胞在恶性转化过程中,产生了许多生化通路的改变,这些癌细胞高度依赖、而正常细胞依赖程度低的生化特征可能是癌细胞的脆弱点,因此可用于对其进行选择性攻击。临床实践及实验研究都证明,癌细胞比正常细胞对ROS更敏感,进一步升高癌细胞的ROS或削弱其抗氧化能力被认为是有效的抗癌方式。淫羊藿是药用价值极高的传统中药,其主要活性成分是淫羊藿苷(Icariin)和淫羊藿素(Icaritin)等。大量研究证明淫羊藿素能诱导多种癌细胞发生凋亡,其机理被认为与JAK/STAT、MAPK或PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制有关。但以上信号通路的抑制与癌细胞凋亡同时发生,其原因-后果关系有待确定。一些研究观察到淫羊藿素处理的癌细胞中ROS水平显著升高并伴随细胞凋亡,但ROS与细胞凋亡之间的因果关系或ROS如何激活凋亡等尚不清楚。为此,本研究对淫羊藿素抑制宫颈腺癌细胞株HeLa和鳞状上皮细胞癌细胞株SiHa的效果以及ROS在其抗癌活性中的作用进行了探讨。首先,MTT实验显示淫羊藿素处理48小时后,HeLa和SiHa两种癌细胞的生长均受到显著抑制(IC_(50)分别为12.5和17μM),而非恶性的CCD?1095Sk成纤维细胞和HEK293人胚肾上皮细胞则只受到轻微影响,说明淫羊藿素对癌细胞有选择性毒性。其次,淫羊藿素处理HeLa和SiHa细胞3小时后,细胞内ROS水平即已显著升高,而用N-乙酰半胱氨酸(NAC)阻断ROS升高后,淫羊藿素的抑制作用即基本消失,说明淫羊藿素引起的ROS升高是其对HeLa和SiHa细胞选择性毒性的基础。接下来的碱性彗星电泳实验表明淫羊藿素处理12小时后,HeLa和SiHa细胞内DNA断裂数量显著上升,加入OGG1 DNA糖苷酶后DNA断裂数进一步升高,而NAC处理阻止了淫羊藿素所致DNA断裂的上升,说明淫羊藿素处理所致ROS升高引起了显著的DNA氧化损伤,由此导致了大量DNA链断裂。免疫荧光染色发现淫羊藿素处理6小时后γH2AX和53BP1阳性细胞数均显著增多,用NAC处理后显著减少,进一步证明淫羊藿素处理引起了大量DNA损伤并激发了DNA损伤反应(DDR)。Western blot检测发现CDC25C-pS216随淫羊藿素处理浓度的加大而升高,而CDK1-pT14水平下降。流式细胞术检测发现淫羊藿素处理HeLa和SiHa细胞24小时后,发生了G_2/M期细胞周期阻滞,NAC处理阻断了CDC25C和CDK1蛋白的变化以及G_2/M期周期阻滞,显示DNA损伤反应激活了G_2/M细胞周期检验点且与淫羊藿素所致ROS有关。Western blot检测同时显示活化的caspase 3和caspase 9以及Bax蛋白随淫羊藿素处理浓度的加大而升高,而Bcl-2和XIAP蛋白下降;流式细胞术和线粒体膜电位检测发现淫羊藿素处理HeLa和SiHa细胞后,凋亡细胞比例呈时间依赖性增加,而NAC处理降低了凋亡蛋白的变化以及凋亡细胞数的上升,显示ROS所致DNA损伤反应同时激活了细胞凋亡。此外,qRT-PCR和Western blot检测结果表明淫羊藿素处理前后HPV E6和E7基因的转录和蛋白水平均无明显改变,提示淫羊藿素对HeLa和SiHa的细胞毒性与HPV病毒基因的表达无关。为了系统地分析淫羊藿素对宫颈癌细胞的作用机理,药物刺激前后HeLa细胞蛋白质组学的变化以同位素二甲基标记和串联质谱技术进行测定。通过对蛋白质提取,分离及质谱鉴定,共同定量到716种蛋白质,药物刺激后,14种蛋白质显著上调,62种蛋白质显著下调。利用生物信息学方法对差异蛋白质进行系统整理与分析。发现差异表达蛋白主要涉及12种分子功能;参与细胞过程调节及刺激应答相关蛋白质数目较多;差异表达蛋白多集中于细胞质、细胞核和外泌体;参与癌症通路等,检测到细胞凋亡相关蛋白基因数6个。印证了淫羊藿素最终诱发宫颈癌细胞内源凋亡途径。为支持淫羊藿素的开发,以计算机辅助的虚拟筛选技术对淫羊藿素的成药性和毒理学性质进行了分析。结果预测淫羊藿素具有很好的水溶性和肠道吸收性;其血浆蛋白结合率小于90%,具有很高的血脑屏障通透性;毒理学性质分析预测淫羊藿素的致突变性和致癌性低,且有良好的ADMET性质。通过本研究,进一步揭示了淫羊藿素的抗癌机理,预测了其具有良好的成药性,为淫羊藿素开发提供了重要数据和参考信息。
【图文】：

淫羊藿苷,分子式,分子,雄激素受体

图 1.2.1 淫羊藿苷分子（A）和淫羊藿素分子式（B）2 淫羊藿素的抗肿瘤作用淫羊藿素对不同类型肿瘤细胞具有明显的抑制作用，淫羊藿素可以抑制增殖、诱导调亡，调控细胞周期、抗血管生成、抑制肿瘤转移和免疫调节多种细胞靶点以及信号通路发挥其抗肿瘤作用。目前已经证实，淫羊藿素癌[93]、白血病[94]、恶性淋巴瘤[95]、前列腺癌[96]、宫颈癌[97]以及肝细胞癌具有抑制增殖和促凋亡作用。如对乳腺癌，2-5μM 的淫羊藿素可发挥抗雌体作用，抑制乳腺癌细胞的增殖，使细胞周期阻滞在 G2/M 期甚至诱发凋生；对于白血病、恶性淋巴瘤以及多发性骨髓瘤等，淫羊藿素表现出剂诱导细胞凋亡，引起周期阻滞于 G2/M 期，且副作用很低[99]；对于前列腺藿素有利于促进雄激素受体（Androgen Receptor，， AR）以及雄激素受体

来源途径

图 1.3.2 ROS 来源途径OS 的清除机制会为细胞带来极大的损害，而细胞也进化出了一述，对于 O2ˉ的清除，主要依赖于 SOD 迅速转化为主要依赖于抗氧化蛋白（peroxiredoxins，PRXs）thione peroxidase，GPXs）以及过氧化氢酶（catal H2O[116，117]。这几种酶会在氧化态与还原态之间实现氧化压力，进行氧化还原反应平衡调节的主要调我保护机制。当进行蛋白酶体亚基调节，异生物质，NRF2 作为一种转录因子被激活，使下游大量蛋2 的存在时间很短，通过与胞浆中的 KEAP1 以及1 相互作用介导蛋白酶体降解过程[119]。当 H2O2的
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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