虎杖炮炙品及热炎宁合剂肝毒性研究

发布时间：2020-03-22 14:56

【摘要】：目的:虎杖生品、虎杖醋炙品、虎杖酒炙品、虎杖盐炙品、虎杖苷、虎杖蒽醌、热炎宁合剂、热炎宁合剂(不含虎杖)以小鼠可灌服最大浓度进行灌胃给药,观察灌胃后药物对小鼠的影响;运用RTCA技术及HCA技术检测虎杖经过炮制后及配伍后是否具减毒作用;运用RTCA技术及HCA技术检测虎杖中虎杖苷以及虎杖蒽醌的毒性;使用倒置显微镜观察对照孔、阳性孔、虎杖生品、虎杖醋炙品、虎杖酒炙品、虎杖盐炙品、虎杖苷、虎杖蒽醌、热炎宁合剂、热炎宁合剂(不含虎杖)作用于人正常肝细胞L-02 24h后对细胞形态学的影响。方法:虎杖炮炙品及热炎宁合剂急性毒性实验:取虎杖生品、虎杖醋炙品、虎杖酒炙品、虎杖盐炙品、热炎宁合剂、热炎宁(不含虎杖)、虎杖苷、虎杖蒽醌8种药物,以小鼠可灌服最大浓度进行灌胃给药,给药体积0.4ml/10g,一天内(间隔8小时)给药3次,连续14天观察小鼠给药后饮食、排泄等情况并计算LD_(50),最后进行一般解剖尸检,观察各器官有无改变;肉眼观察心脏、肺、胃、小肠、肝脏、肾脏及脾脏,对有变化的脏器需进行组织病理学检查。RTCA检测虎杖炮炙品及热炎宁合剂对人正常肝细胞L-02毒性实验:用10%FBS DMEM培养液稀释细胞悬液密度到6×10~4个/ml,于E-16plate中每孔加入100μl细胞悬液,大约24h后每孔加入相应浓度药物,对照孔加入10%FBS DMEM培养液,阳性孔加入对1.25mg/ml乙酰氨基酚溶液,放回三气培养箱连续检测56小时。形态学观察实验:用10%FBS DMEM培养液调整细胞悬液浓度为6×10~4个/ml,于96孔板中每孔加入100μl人正常肝细胞L-02悬液,大约24h后每孔加入相应浓度的药物,对照孔加入DMEM培养液,阳性孔加入1.25mg/ml对乙酰氨基酚溶液,放回三气培养箱继续培养24h后,用无菌PBS溶液轻轻清洗每孔,然后在倒置显微镜10X物镜下观察细胞形态学的变化。HCA评价虎杖炮炙品及热炎宁合剂对人正常肝细胞L-02毒性实验:用10%FBS DMEM培养液稀释细胞悬液密度到6×10~4个/ml,96孔板中每孔加入100μl细胞悬液,大约24h后每孔加入相应浓度药物,对照孔加入10%FBS DMEM培养液,阳性孔加入对1.25mg/ml乙酰氨基酚溶液,放回三气培养箱连续培养24h,吸弃药液及培养基,加入探针孵育30min,上机检测。结果:虎杖及热炎宁合剂急性毒性实验:虎杖生品、虎杖醋炙品、虎杖盐炙品、虎杖酒炙品、热炎宁合剂、热炎宁合剂(不含虎杖)、虎杖苷、虎杖蒽醌毒性较小,以小鼠可灌服的最大浓度以最大灌胃体积灌胃给药,各组小鼠未出现死亡,每日积累最大耐受量(MTD)分别为799.2g/kg、944.4g/kg、968.4g/kg、912g/kg、817.2g/kg、558g/kg、75.6g/kg、96g/kg,各给药组体重与空白组相比无显著性差异。RTCA技术检测虎杖炮炙品及热炎宁合剂对人正常肝细胞L-02的毒性实验:虎杖生品与蒲公英、北败酱、半枝莲配伍的复方制剂热炎宁合剂的毒性小于虎杖生品的毒性,热炎宁的毒性大于热炎宁(不含虎杖)的毒性,作用于人正常肝细胞L-02 24小时,IC_(50)分别为13.08mg/ml、11.81mg/ml、13.32mg/ml,作用于人正常肝细胞L-02 48h,IC_(50)分别为12.44mg/ml、,11.97mg/ml、13.14mg/ml。虎杖经过炮制后其毒性降低,醋炙品、酒炙品、盐炙品作用人正常肝细胞L-02 24h,IC_(50)分别为12.15mg/ml、15.23mg/ml、31.26mg/ml;作用于人正常肝细L-02 48h,IC_(50)分别为12.00mg/ml、16.10mg/ml、69.97mg/ml。通过对比分析可以得出毒性大小:生品醋炙品酒炙品盐炙品;虎杖苷与虎杖蒽醌作用于人正常肝细胞L-02 IC_(50)分别为,24h为263.05μg/ml、50.62mg/ml;48h为264.25μg/ml、52.81mg/ml。细胞形态学观察:在倒置显微镜10X物镜下观察,与对照孔相比较,阳性孔显著抑制细胞的增殖,虎杖生品、虎杖醋炙品、虎杖酒炙品、虎杖盐炙品、热炎宁合剂(不含虎杖)、热炎宁合剂、虎杖苷、虎杖蒽醌类均呈现随着药物浓度增加细胞数量显著减少,形态发生明显变化。HCA评价虎杖炮炙品及热炎宁合剂对人正常肝细胞L-02毒性实验:虎杖生品、虎杖醋炙品、虎杖酒炙品、虎杖盐炙品、虎杖苷混悬液、虎杖蒽醌、热炎宁合剂、热炎宁合剂(不含虎杖)作用于人正常肝细胞24h,与阴性孔相比较,药物作用后,细胞数目减少,线粒体膜电位降低、细胞面积变小,且具有梯度依赖性。结论:虎杖炮炙品及热炎宁合剂无明显急性毒性反应;虎杖经过炮制和配伍后其毒性均降低。
【图文】：

生长曲线,检测板,连续检测,实时动态

由图 1 可知， 1×105个 /ml、 8×104个 /ml、 6×104个 /ml、 4×104个 /的人正常肝细胞 L-02 接种于 E-plate 16 检测板中，实时动态连续检测生长 100h，观察不同密度人正常肝细胞 L-02 生长曲线。图中横坐标数为时间，纵坐标数值为 CI 值。CI 值越高代表细胞活性越高，由于细胞殖的特点，当在孔中细胞数目达到一定数量，即细胞增殖进入平台期CI 值也不再增加。密度在 1×105个 /ml、 8×104个 /ml 时，人正常肝细L-02 能够快速进入对数期，大约在 40 多个小时进入平台期，，不能够满实验要求；密度为 4×104个/ml 时，L-02 人正常肝细胞进入对数期较晚（值大于 0.5 认为进入对数期），因此选择 6×104个/ml 作为最优密度。4.2 RTCA 技术检测虎杖生品、热炎宁合剂、热炎宁合剂（不含虎杖）人正常肝细胞 L-02 生长的影响

生品,虎杖,技术检测,检测板

由图 2 可知，运用 RTCA 技术检测不同浓度的虎杖生品对人正常肝细胞 L-02 增殖的影响。6×104个/ml 的人正常肝细胞 L-02 接种于 E-plate 1检测板中，实时动态检测其生长至约 24h，将 E-plate16 检测板取出于超净工作台上，加入不同浓度的虎杖生品。再将 E-plate16 检测板置于仪器上继续检测约 56h，观察虎杖生药对人正常肝细胞 L-02 生长的影响。图中横坐标代表时间，纵坐标代表 CI 值。CI 值越高代表细胞活性越高，由于细胞增殖的特点，当在孔中细胞数目达到一定数量，即细胞增殖进入平台期，CI 值也不再增加。实验表明：人正常肝细胞 L-02 在 E-Plate 16 上生长状态较好。与对照组相比，阳性组基本完全抑制人正常肝细胞 L-02 的增殖。与对照组相比较，虎杖生品不同的浓度对人正常肝细胞 L-02 均有抑制作用，尤以46.25mg/ml、23.13mg/ml 对人正常肝细胞 L-02 毒性作用最强，随着浓度
【学位授予单位】：河南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】