基于固相萃取-气相色谱-质谱联用的生物样品中短链脂肪酸分析方法建立及应用

发布时间：2020-03-22 17:06

【摘要】：背景:短链脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)是指碳链中碳原子数目小于6个的有机脂肪酸,由肠道菌群代谢产生,主要包含7种,分别是乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸。生物体内的SCFAs主要为乙酸、丙酸和丁酸,约占SCFAs总量的90%～95%。研究表明,SCFAs具有调节肠道菌群平衡,改善肠道功能,以及抗肿瘤、抗炎和调控基因表达等作用。检测体内SCFAs变化可揭示药物作用机制及辅助临床疾病的诊断、治疗。因SCFAs具有易挥发性,极性大且在生物样本中含量低等特点,当前的SCFAs分析方法存在前处理复杂、检测稳定性差等缺点。因此,建立更准确高效的SCFAs分析方法尤为重要。目的:为适用不同样本中SCFAs含量趋势分析,建立不同生物样品中SCFAs的定性半定量分析方法,并应用于探究滇黄精多糖与滇黄精水提物对脂代谢紊乱与非酒精性脂肪肝大鼠SCFAs的调节机制。方法:生物样品中SCFAs定性分析:取SPF级雄性SD大鼠粪便、肝门静脉血、组织(肝脏、胰腺、心脏、脾脏、肾脏、肺),用甲醇沉淀蛋白后调节p H提取粪便中SCFAs,用阴离子交换树脂(PAX)为填料的固相萃取小柱富集肝门静脉血和组织中SCFAs。样品经气相色谱/质谱(GC/MS)检测,利用计算机检索标准质谱库进行识别得到化合物信息,再通过与混合对照品进行比对指认鉴定样品中SCFAs的组成。生物样品中SCFAs半定量分析方法建立:取SPF级雄性SD大鼠粪便、肝门静脉血、肝脏,用甲醇沉淀蛋白后调节p H净化粪便样品,用PAX为填料的固相萃取小柱高通量净化肝门静脉血和组织样品(1次可同时净化96个样品)后,采用GC/MS进行分析。考察方法的线性与范围、精密度、重复性及稳定性。。生物样品中SCFAs半定量分析及应用:将所建半定量分析方法用于测定脂代谢紊乱大鼠与非酒精性脂肪肝大鼠样本(粪便、肝门静脉血、肝脏)中SCFAs。并用Pearson相关性分析分析SCFAs含量与肠道菌群、脂质参数的关联性,探究滇黄精多糖对脂代谢紊乱大鼠SCFAs的调节作用及滇黄精水提物对非酒精性脂肪肝大鼠SCFAs的调节作用。结果:从粪便及肝门静脉血中鉴定出7种SCFAs,分别为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸;从肝脏、脾脏、肾脏、肺中鉴定出5种SCFAs,分别为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸;在部分胰腺样本及心脏样本中鉴定出6种SCFAs,分别为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、己酸。所建半定量分析方法经方法学考察,不同生物样品(粪便、肝门静脉血、组织)中SCFAs在0.005～0.1 mol/L范围内线性关系良好(r0.999),仪器精密度RSD2.23%,样品稳定性RSD5.07%,方法重复性RSD3.05%,均符合生物样品定量分析要求。给予滇黄精多糖,脂代谢紊乱大鼠粪便、肝门静脉血、肝脏中丁酸含量增加;相关性分析表明,粪便Butyrivibrio的丰度变化与丙酸显著负相关性,Peptococcus、Allobaculum、Blautia的丰度变化与乙酸呈显著负相关性,其中Allobaculum、Blautia还与丙酸显著负相关性。Clostridium的丰度变化与异丁酸、丁酸呈显著正相关性。同时,Roseburia的丰度变化与丁酸呈正相关性。Bacteroides的丰度变化与戊酸呈显著正相关性。肝门静脉血中LDL-C含量与乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸含量显著正相关。肝脏中TG含量与丁酸含量显著正相关。推测该途径为滇黄精改善脂代谢紊乱的新通路。给予滇黄精水提物,非酒精性脂肪肝大鼠肝门静脉血、肝脏中丁酸含量升高。相关性分析表明,TC及ALT与丁酸呈负相关,丁酸可能通过AMPK乙酰Co A羧化酶途径增加肝脏脂质氧化,增加糖原储存和降低肝脏脂肪酸合成酶活性干预非酒精性脂肪肝。结论:粪便、肝门静脉血、组织(肝、心、脾、肺、肾)中均含有SCFAs,且不同样本中SCFAs种类有差异;所建的基于高通量固相萃取-气相色谱-质谱联用的半定量分析法可用于生物样品(粪便、肝门静脉血、肝脏、脾)中SCFAs快速、高效分析;分析结果表明,滇黄精多糖与滇黄精水提物可显著调节脂代谢紊乱与非酒精性脂肪肝大鼠中的SCFAs,这些调节方式是药物发挥药效的重要机制。
【图文】：

图 1-1 粪便样品总离子流图1， 乙酸；2，丙酸；3，异丁酸；4，丁酸；5，，异戊酸；6，戊酸；7，己酸表 1-1 粪便样品中 7 种 SCFAs 的 GC/MS 信息及结构指认序号 名称 保留时间（min） 质荷比（m/z） 定性离子1 乙酸 3.15 60.05 43,45,602 丙酸 3.80 74.08 29,45,57,743 异丁酸 4.05 88.11 41,43,73,884 丁酸 4.60 88.11 41,55,60,735 异戊酸 5.02 102.12 41,43,60,876 戊酸 5.73 102.13 41,55,60,737 己酸 6.92 116.16 41,60,73,87

图 1-2 肝门静脉血样品总离子流图1， 乙酸；2，丙酸；3，异丁酸；4，丁酸；5，异戊酸；6，戊酸；7，己酸表 1-2 肝门静脉血样品 7 种 SCFAs 的 GC/MS 信息及结构指认序号 名称 保留时间（min） 质荷比（m/z） 定性离子1 乙酸 3.11 60.05 43,45,602 丙酸 3.75 74.08 29,45,57,743 异丁酸 3.99 88.11 41,43,73,884 丁酸 4.55 88.11 41,55,60,735 异戊酸 4.96 102.12 41,43,60,876 戊酸 5.68 102.13 41,55,60,737 己酸 6.87 116.16 41,60,73,87
【学位授予单位】：云南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2595353