基于突触体蛋白质组学研究惊厥的发生机制及人参对惊厥的防治作用

发布时间：2020-03-22 18:27

【摘要】：由感染、高热所导致的小儿惊厥在临床上十分普遍,长时间反复性的惊厥可能导致急性海马损伤和海马萎缩,进而影响患者的认知、学习和记忆能力,可成为后期癫痫发生的基础。针对热性惊厥,目前临床上以支持疗法为主,对于持续状态的惊厥,应用抗癫痫药物以增强γ-氨基丁酸的作用。然而,感染、高热这两个因素是如何协同地诱导惊厥,这两个因素对中枢神经系统,特别是对海马组织的突触蛋白网络会产生什么样的改变?目前还不十分清楚。本研究欲建立大鼠脑组织突触体的蛋白质组学方法,并应用该法研究高热、感染因素对海马突触蛋白组的影响,寻找其导致惊厥的关键分子或通路;进而研究对中枢神经系统有广泛作用的人参对脑组织突触蛋白组的影响,揭示人参防治中枢神经系统疾病的本质,试图发现人参中对惊厥的发生有抑制作用的活性成分。第一部分大鼠不同脑区突触体蛋白质组学的研究目的:建立大鼠脑组织突触体的蛋白质组学研究方法,并应用该法研究大鼠额叶皮层、顶叶皮层、海马体、纹状体、嗅球和小脑皮层突触体中的蛋白质。方法:以Percoll为密度梯度介质离心制备突触体,并进行电镜观察和蛋白印记验证;考察突触体蛋白的提取方法,优化还原烷基化及酶切过程,应用纳升液相质谱联用技术检测酶切后的肽段,根据数据库解析在突触体中检测到的蛋白质。结果:离心制备后,富集突触体的部分在透射电镜下可见多个结构完整、形状大小不一的突触体,可以清晰地看到突触后致密层、囊泡及线粒体,Western Blot检测到了突触前膜的特异性标志物Synaptophysin及突触后膜的特异性标志物PSD 95。经过考察,优化的突触体样品前处理方法如下:以8 mol/L的尿素缓冲溶液为裂解液,提取后的蛋白经过二硫苏糖醇及碘乙酰胺的还原烷基化,再进行胰酶及Lys-C酶的顺序酶切。酶切后的肽段经纳升液相质谱联用技术检测,即可实现对突触体蛋白质的定性定量。应用该法研究了大鼠不同脑区的突触体蛋白质组学,两次重复实验共同鉴定出了2920个蛋白质,包括突触蛋白、突触后致密层蛋白、线粒体蛋白、突触囊泡蛋白、突触前膜蛋白等;应用不同的聚类方法进一步研究这些蛋白的分布规律,结合生物信息学知识,发现在特定脑区的突触体中表达相对较高的蛋白能够代表其所在脑区的功能,证明了本部分所建立的突触体蛋白质组学方法的可行性。小结:本部分建立了大鼠脑组织突触体蛋白组学的方法,所得到的不同脑区突触体蛋白表达的数据还可为其它研究提供数据支持与参考。第二部分基于海马的突触体蛋白质组学探究惊厥发生的分子机制目的:研究高热、感染这两种致惊厥因素对海马突触体蛋白表达的影响,揭示惊厥发生的分子机制。方法:应用蛋白质组学的方法研究高热、脂多糖(LPS)处理后动物海马突触体蛋白表达谱的变化,结合生物信息学分析,寻找导致惊厥发生的分子机制,并应用脑电记录的方法进行验证。结果:将LPS组和对照组相比发生显著变化的蛋白,与高热组和对照组相比发生显著变化的蛋白进行分析,发现这两种处理因素共同使1313个蛋白的表达发生了变化,且其中的1312个蛋白表达的变化趋势一致,说明高热和感染具有共同的作用基础,是二者可协同诱发惊厥的原因。通路分析及蛋白相互作用分析揭示谷氨酸能突触通路在惊厥时发生了主要的改变,特别是以AMPA受体为核心的蛋白网络发生了明显的改变(以上调为主),脑电记录进一步证明了AMPA受体的特异性抑制剂NBQX能够抑制惊厥所导致的海马癫痫样放电,表明AMPA受体与感染和高热导致的惊厥密切相关。小结:LPS和高热因素可使一些突触蛋白发生趋势一致的改变,且以AMPA受体为核心的蛋白网络与感染和高热导致的惊厥密切相关第三部分基于突触体蛋白质组学研究人参对惊厥的防治作用目的:研究人参对脑组织突触体蛋白的影响,揭示人参对中枢神经系统疾病防治的本质,找出人参发挥作用的物质基础,并验证其对惊厥的抑制作用。方法:应用蛋白质组学的方法研究大鼠长期服用人参后海马和皮层突触体蛋白质表达的变化,并分析人参对线粒体氧化磷酸化通路相关蛋白表达的影响;体外制备线粒体,应用线粒体呼吸测定系统找出人参发挥作用的物质成分;应用脑电记录的方法观察人参皂苷对惊厥的抑制作用。结果:人参可以下调大鼠海马和皮层突触体中线粒体相关蛋白的表达,影响线粒体的氧化磷酸化过程;线粒体呼吸试验证实人参提取液及人参皂苷Rb1、Rg1、Rc、Rb2、Rd可以抑制皮层和海马线粒体的氧化磷酸化过程,抑制ATP合酶活性,其中人参皂苷Rd作用最强;应用脑电记录的方式证明人参皂苷Rd可以抑制惊厥所导致的海马癫痫样放电,达到脑保护的作用。小结:人参主要影响中枢神经系统线粒体的氧化磷酸化过程,人参皂苷,特别是人参皂苷Rd是人参抑制线粒体氧化磷酸化的主要活性成分,人参皂苷Rd可以抑制惊厥所导致的海马癫痫样放电,可用来防治惊厥的发生。结论:1.建立了脑组织突触体蛋白质组学的研究方法,通过研究不同脑区突触体蛋白的表达证明了该方法的可行性,所得到的数据可为其它研究提供参考。2.感染和高热均可改变海马突触体中的一些蛋白的表达,可能是二者协同诱发惊厥的根本原因;而组学分析表明以AMPA受体为核心的蛋白网络与感染和高热导致的惊厥密切相关。3.人参提取液及部分人参皂苷可以抑制皮层和海马线粒体的氧化磷酸化过程,抑制ATP合酶活性;人参皂苷Rd可以抑制惊厥所致的海马癫痫样放电。
【图文】：

质谱数据,数据解析,基本流程

31图 1-1 质谱数据采集及数据解析的基本流程Fig. 1-1 The basic schemes for mass data acquisition and data analysis. TheMS2-based (A) and SPS-MS3-based (C) methods were shown in this figure.There are the protein identification scheme (B) and the protein simultaneousidentification and quantification scheme (D)

突触体

图 1-2 突触体的 Percoll 密度梯度分离图aptosomes were separated by Percoll gradienlar fractions are generated, and synaptosomes
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】