天然和人工合成黄酮类化合物对容积激活氯离子通道的调节作用以及选择性研究

发布时间：2020-03-23 02:47

【摘要】：天然黄酮类化合物(Natural flavonoids)普遍存在于水果、蔬菜、茶、葡萄酒、种子或是植物根中,具有抗病毒、抗氧化、心血管保护和抗癌作用。容积激活氯离子通道(Volume-regulated anion channels,VRACs)组织分布广泛,在维持细胞容积和离子平衡方面发挥重要作用,并参与调节多种细胞增殖、分化及凋亡等过程,在跨上皮转运和癌症发展中起关键作用。VRACs通道阻断剂可抑制血管内皮细胞增殖、血管生成与重构以及肿瘤的发展,故开发高效、特异性的VRACs阻断剂具有很高的价值。因此本实验的研究目的是探索VRACs通道高特异性阻断剂,并初步研究黄酮类化合物调节血管生成的机制。本实验采用全细胞膜片钳技术(whole cell patch clamp technique)记录人胚胎肾细胞(HEK293)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的VRACs电流,检测黄酮类化合物对VRACs通道调节作用及选择性研究,并采用5'-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)测定技术研究黄酮类化合物对HUVEC细胞增殖的影响。本研究主要包括以下两部分:(1)天然和人工合成黄酮类化合物对容积激活氯离子通道的调节作用;(2)人工合成黄酮类化合物黄酮哌酯(Flavoxate)及其代谢产物3-甲基黄酮-8-羧酸(3-methylflavone-8-carboxylic acid,MFCA)对容积激活氯离子通道(VRACs)、TMEM16A编码的Ca~(2+)激活Cl~-通道(Calcium-activated chloride channels,TMEM16A/CaCCs)的调节作用及选择性研究。第一部分天然和人工合成黄酮类化合物对VRACs通道的调节作用目的:探讨天然和人工合成黄酮类化合物对VRACs通道的调节作用以及调节血管生成的机制。方法:采用全细胞膜片钳技术记录天然和人工合成黄酮类化合物对低渗外液激活的HEK293和HUVEC细胞中的VRACs电流的影响,并利用BrdU技术检测药物对细胞增殖的影响。结果:1.天然黄酮类化合物对HEK293细胞中VRACs电流的影响100μM时,53种黄酮类化合物中有34种对VRACs电流的抑制率大于50%,其中木犀草素(luteolin),黄芩素(baicalein),半齿泽兰素(eupatorin),高良姜素(galangin),槲皮素(quercetin),漆黄素(fisetin),水黄皮素(karanjin),二氢桑色素(Dh-morin),染料木素(genistein),葛花苷元(irisolidone)和樱黄素(prunetin)的抑制率最高(抑制率均大于80%)。2.天然黄酮类化合物对HEK293细胞VRACs电流量效关系曲线的影响我们在-100 mV电压下记录了不同浓度的药物对VRACs电流的影响,并建立了量效关系曲线。结果显示,其IC_(50)s范围为5-13μM,E_(max)s范围为87-99%。3.天然黄酮类化合物对HEK293细胞VRACs电流-电压(I-V)关系曲线的影响我们观察了3μM和30μM的药物以及10μM DCPIB对VRACs通道I-V关系曲线的影响,结果说明这些药物能浓度依赖性地抑制VRACs电流,但并不影响其翻转电位。4.天然黄酮类化合物对HUVEC细胞VRACs电流的影响与在HEK293细胞中观察到的药物对VRACs电流结果一致,100μM的luteolin,baicalein,galangin,quercetin,fisetin和genistein以及10μM DCPIB能显著性地抑制HUVEC细胞中VRACs电流。而flavone(黄酮),herbacetin(草质素),daidzein(大豆苷元),genistin(染料木苷)和catechin(儿茶素)对HUVEC细胞中的VRACs电流的抑制作用较弱。5.天然黄酮类化合物对HUVEC细胞增殖的影响结果显示,对VRACs电流抑制作用较强的11种天然黄酮类化合物(除Dh-morin外)可显著抑制HUVEC细胞增殖。6.人工合成黄酮类化合物对HEK293细胞VRACs电流的影响100μM时,flavoxate,alovcidib和diosimin可显著抑制VRACs电流,抑制率分别为87.84±0.86%;71.33±1.31%;56.98±5.12%,其中flavoxate对VRACs电流抑制作用最强。7.Flavoxate对HEK293细胞VRACs电流量效关系曲线及电流-电压(I-V)关系曲线的影响我们建立了flavoxate调节HEK293细胞中VRACs电流的量效关系曲线,其IC_(50)为2.25±0.30μM,E_(max)为91.81±2.74%。我们观察了3μM和30μM的flavoxate以及10μM的DCPIB对VRACs电流的I-V关系曲线的调节作用,发现flavoxate能显著抑制VRACs电流,但不影响其翻转电位。第二部分人工合成黄酮类化合物黄酮哌酯及其活性代谢产物对VRACs通道的选择性研究目的:探讨Flavoxate及其活性代谢产物MFCA对VRACs通道的选择性作用。方法:采用全细胞膜片钳技术记录flavoxate及活性其代谢产物MFCA对VRACs及TMEM16A/CaCCs的选择性作用。结果:1.实验中所记录的电流为钙激活氯离子电流当钙离子通过电极尖端进入细胞膜后,细胞内钙离子浓度不断增加会逐渐激活电流,此时细胞内游离钙离子浓度为384 nM,因此确定所记录电流为钙激活氯离子电流,当电流趋于平稳后即可给药。2.Flavoxate及MFCA对VRACs的调节性作用100μM时flavoxate能显著抑制低渗外液激活的VRACs电流,抑制率为89.43±0.92%;同样100μM时MFCA也能显著抑制VRACs电流,抑制率为72.62±1.58%。3.Flavoxate及MFCA对TMEM16A/CaCCs的调节性作用100μM时flavoxate对TMEM16A/CaCCs电流的抑制率约为35%。通过观察30μM flavoxate及MFCA对TMEM16A/CaCCs电流的I-V曲线的影响发现:flavoxate及MFCA均能抑制TMEM16A/CaCCs电流。30μM时flavoxate对TMEM16A/CaCCs电流的抑制作用较弱,抑制率为21.11±2.74%;同样30μM时MFCA对TMEM16A/CaCCs电流的抑制作用也较弱,抑制率为19.25±2.30%。结论:1.天然和人工合成黄酮类化合物可以显著抑制VRACs通道电流,这些药物可能通过阻断VRACs通道电流进而达到抑制血管生成的作用。2.Flavoxate及其活性代谢产物MFCA对VRACs通道具有较高选择性。
【学位授予单位】：河北中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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1 赵雪巍;刘培玉;刘丹;孙珊珊;李贞;余可馨;张Z诶，

本文编号：2596054