益气活血通络方通过JNK信号通路对高糖诱导人脐静脉内皮细胞炎症和凋亡的影响及机制研究

发布时间：2020-03-23 07:33

【摘要】：目的:观察益气活血通络方对体外高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)炎症和凋亡的影响,探讨其与JNK信号通路的关系,阐释基于JNK通路的益气活血通络方对糖尿病周围神经病变(Diabetic Peripheral Neuropathy,DPN)干预作用的细胞分子机制。方法:1、体外培养HUVECs,然后用不同处理因素的DMEM培养基(葡萄糖浓度分别为:5.55mmol/L、11.1mmol/L、22.2mmol/L、33.3mmol/L、44.4mmol/L)分别培养12h、24h、48h。用MTT法、Hoechst 33258荧光染色法和流式细胞术三种方法分别检测不同浓度葡萄糖在不同时间点对脐静脉内皮细胞存活率及凋亡的影响。2、选择健康的SPF级SD雄性大鼠30只,随机分为两组:益气活血通络方含药血清组、大鼠空白对照血清组。两组分别予以中药复方益气活血通络方和等体积的生理盐水灌胃,制备相应的含药血清。将细胞传代后,随机分为6组:正常组、模型组、益气活血通络方低浓度组、益气活血通络方中浓度组、益气活血通络方高浓度组和西药硫辛酸对照组。将HUVECs进行高糖造模48h后,分别加入含大鼠空白血清的低糖培养基、含不同浓度药物血清的高糖DMEM培养基和含西药硫辛酸的高糖培养基干预细胞24 h。用酶联免疫吸附法和Western blotting法检测内皮细胞上清液中和细胞内炎性因子IL-1β、TNF-α的表达。3、用高浓度葡萄糖给细胞造模48h后,分别用不同浓度的含药血清和西药硫辛酸对细胞进行干预。24 h后Western blotting法检测内皮细胞中JNK、P-JNK蛋白的表达;荧光定量PCR的方法测定脐静脉内皮细胞中JNK mRNA的相对表达量。用Hoechst 33258荧光染色法和Annexin V-FITC/PI双染法观察益气活血通络方对脐静脉内皮细胞形态学和凋亡率的影响。收集细胞,Western blotting和RT-PCR法分别检测内皮细胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白和mRNA的表达。结果:1、MTT法检测不同浓度葡萄糖干预不同时间对HUVECs存活率的影响:葡萄糖浓度为33.3 mmol/L的高糖培养基培养内皮细胞48 h后,细胞的存活率趋于50%,活力显著降低(P0.01)。经Hoechest 33258荧光染色法和流式细胞术AnnexinV FITC/PI双染色法检测发现,随着培养基内葡萄糖浓度的增加和高糖干预时间的延长,凋亡细胞逐渐增加。当用葡萄糖浓度为33.3 mmol/L的高糖培养基处理细胞48 h时,内皮细胞凋亡的细胞数明显增加,而且呈现出致密的浓染,细胞核的形态变化明显,细胞凋亡率也显著增加。2、益气活血通络方对内皮细胞炎性因子表达的影响:与正常组比较,高浓度的葡萄糖可引起HUVECs内IL-1β及TNF-α分泌增加,使这两个炎性因子蛋白表达均增高(P0.05);与模型组比较,各浓度的益气活血通络方含药血清和西药硫辛酸可以显著抑制IL-1β、TNF-α的分泌和蛋白的高表达(P0.05)。3、益气活血通络方对JNK信号通路的影响:与正常组相比,用高浓度的葡萄糖刺激,可显著增加HUVECs内JNK、P-JNK蛋白的表达,增加JNK m RNA的相对表达量;用益气活血通络方含药血清及西药硫辛酸干预以后,均可显著降低细胞内JNK、P-JNK的表达(P0.01)。益气活血通络方对细胞凋亡的影响:与正常组比较,浓度为33.3 mmol/L的高糖模型组细胞存活率显著降低,内皮细胞的染色质向边缘聚集,细胞核固缩且呈现出致密的浓染,细胞的凋亡率明显升高,内皮细胞内Bax及Caspase-3蛋白和mRNA的表达显著增加,Bcl-2蛋白及m RNA的表达显著降低(P0.01);用益气活血通络方含药血清及西药硫辛酸干预以后,均可显著减轻高糖对HUVECs增殖的抑制及其诱导的细胞凋亡,减少内皮细胞中Bax及Caspase-3的表达,增加Bcl-2的表达(P0.05,P0.01)。结论:1、33.3 mmol/L的高浓度葡萄糖培养人脐静脉内皮细胞48h,可明显抑制细胞活性,刺激细胞产生炎性因子,激活JNK通路,HUVECs呈现明显的凋亡特征,细胞凋亡率显著升高;2、益气活血通络方可明显抑制脐静脉内皮细胞内炎性因子的分泌,降低内皮细胞中JNK的表达,对HUVECs的凋亡具有明显的抑制作用。3、益气活血通络方可减轻高糖诱导的内皮细胞炎性损伤,并可以抑制内皮细胞的凋亡,从而对糖尿病周围神经起到保护的作用,其机制可能与JNK信号转导通路有关。
【图文】：

核形态,细胞凋亡,葡萄糖,凋亡细胞

第一部分高糖对人脐静脉内皮细胞增殖及凋亡的影响3.2 高糖对 HUVECs 凋亡形态的影响3.2.1 Hoechst33258 荧光染色法观察不同浓度葡萄糖诱导 HUVE48h 后细胞凋亡形态的变化染色结果显示，用不同浓度的葡萄糖（5.55mmol/L、11.1mmol/L、22.2 m3.3 mmol/L、44.4mmol/L ）干预 HUVECs 48 h 后，正常细胞的细胞核呈弥匀暗淡的蓝色荧光，而凋亡细胞的细胞核普遍呈现蓝白色，呈致密的浓染显核形态变化（如图中的箭头所示）。随着葡萄糖浓度的增加，凋亡细胞的来越多，且呈剂量依赖性地增多。与 5.55mmol/L 组相比，当葡萄糖浓度为mol/L 时，，凋亡细胞数增加，核形态变化明显。（见图 1）

葡萄糖,双染色,糖浓度,流式细胞术

图 2： 33.3 mmol/L 葡萄糖作用不同时间对 HUVECs 凋亡形态的的影Fig 2: Effects of 33.3 mmol / L glucose on apoptosis morphology of Hdifferent Time (×100).流式细胞术检测高糖对 HUVECs 凋亡的影响.1AnnexinV FITC/ PI 双染色法检测不同浓度的葡萄的影响如图 3 所示，用不同浓度的葡萄糖（5.55mmol/L、11.1mmol/ mmol/L、 44.4mmol/L ）干预 HUVECs 48 h 后，与 5.55mm度的高糖均能引起细胞凋亡的发生，随着糖浓度的增加，细
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】