滋阴化痰方抑制胃癌转移的作用及其相关分子机制探讨

发布时间：2020-03-24 19:35

【摘要】：研究目的:胃癌是一种在我国相对和绝对发病率均很高的恶性肿瘤。近年来虽然早诊早治大大改善了胃癌的整体预后,但临床进展期胃癌的综合治疗疗效仍欠理想。本科室基于胃癌痰证理论创制的针对晚期胃癌的滋阴化痰方临床疗效肯定,但其发挥疗效的分子机制尚未明确。本研究拟首先借助网络药理学方法,预测其可能的效应及作用机制,进而通过体内外实验进行验证,以期为阐明其作用机制提供数据支持。研究方法:1.运用网络药理学方法查找滋阴化痰方各药物所含的有效化学成分,并预测其潜在的抗肿瘤靶点。通过DAVID数据库进行GO(gene ontology)生物学过程和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析,预测其治疗肿瘤可能的作用途径及作用机制。2.运用CCK-8法,探索不同浓度的滋阴化痰方对SGC-7901和MGC-803两株胃癌细胞增殖的影响,筛选其抑制迁移和侵袭的无毒剂量。3.运用划痕实验和Transwell小室实验观察滋阴化痰方对SGC-7901和MGC-803细胞迁移和侵袭的影响。4.运用WB(Western blot)和q-PCR的方法,检测滋阴化痰方作用于SGC-7901和MGC-803细胞后MMP2、MMP9、Snail、Slug、Vimentin、E-Cadherin、N-Cadherin和RUNX3等基于网络药理学筛选出的潜在作用靶点的变化。5.运用CRISPR/Cas9技术,将RUNX3基因敲除,并转染SGC-7901细胞后,再次通过划痕愈合和Transwell小室实验验证滋阴化痰方是否通过上调RUNX3的表达发挥抑制胃癌侵袭转移的作用。并运用WB的方法,检测RUNX3基因敲除后滋阴化痰方对E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9等转移相关蛋白表达的影响。6.构建胃癌裸鼠肺转移模型,结合RUNX3基因敲除,观察滋阴化痰方对胃癌细胞肺转移能力的影响,进而运用WB和免疫组化的方法,观察其对下游转移相关蛋白表达的影响。7.通过HUVECs管腔形成实验,观察滋阴化痰方与SGC-7901和MGC-803细胞共培养后上清液对HUVECs管腔形成能力的影响;通过胃癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察滋阴化痰方对瘤体组织微血管密度的影响。8.运用ELISA、q-PCR和WB的方法,观察滋阴化痰方对SGC-7901和MGC-803细胞及细胞上清、荷瘤裸鼠血液和瘤体组织中VEGFA和VEGFC表达水平的变化。结果:1.网络药理学分析结果显示,滋阴化痰方主要可能影响包括细胞外基质的降解、上皮-间质转换、细胞迁移、细胞局部粘附、基质金属蛋白酶活性、划痕愈合、血管新生等在内的GO生物学过程。2.CCK-8实验表明,随着滋阴化痰方浓度的不断提高,其抑制SGC-7901和MGC-803胃癌细胞增殖的能力逐渐增强,当其浓度低于100μg/mL时,其对两株胃癌细胞的增殖影响非常微弱,因此我们选取25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL作为下一步探究其抑制胃癌侵袭转移分子机制的低、中、高剂量。3.划痕实验和Transwell实验结果表明,随着滋阴化痰方浓度的不断提高,其抑制SGC-7901和MGC-803胃癌细胞迁移和侵袭的能力逐渐增强。4.WB和q-PCR的结果表明,滋阴化痰方能够抑制MMP2、MMP9、N-Cadherin和Vimentin的表达,并上调RUNX3和E-Cadherin的表达,但对Snail和Slug表达作用不显著。5.运用CRISPR/Cas9技术,成功构建SGC-7901-RUNX3~(-/-)稳定株,划痕愈合和Transwell小室实验结果表明,滋阴化痰方能够通过上调RUNX3的表达抑制胃癌侵袭迁移;WB实验结果表明,与SGC-7901正常组细胞相比,滋阴化痰方干预SGC-7901-RUNX3~(-/-)细胞的E-Cadherin的蛋白表达量下调,而N-Cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9的蛋白表达量升高。6.以SGC-7901和SGC-7901-RUNX3~(-/-)细胞成功建立胃癌裸鼠肺转移模型,体内实验结果表明,相比生理盐水空白对照组,滋阴化痰方可明显抑制模型小鼠的肺转移能力;在RUNX3基因敲除后,再次给予滋阴化痰方干预,其抑制胃癌细胞肺转移的能力也相应减弱。与正常组相比,模型小鼠给予滋阴化痰方干预后生存时间明显延长;WB和免疫组化的结果表明,滋阴化痰方干预RUNX3基因敲除后肺转移小鼠的E-Cadherin的蛋白表达量明显下调,而N-Cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9的蛋白表达量则明显升高。7.HUVECs管腔形成实验表明,滋阴化痰方可明显抑制HUVECs的管腔形成能力;裸鼠体内实验结果表明,滋阴化痰方能够降低裸鼠皮下移植瘤瘤体组织的微血管密度,抑制瘤体内微血管的形成。8.ELISA、q-PCR和WB实验结果表明,滋阴化痰方能够降低SGC-7901和MGC-803细胞及细胞上清、荷瘤裸鼠血液和瘤体组织中VEGFA和VEGFC的表达。结论:1.滋阴化痰方在体内外具有抑制胃癌的侵袭和迁移的作用,该作用与其上调RUNX3的表达相关。2.滋阴化痰方在体内外具有抗胃癌血管新生的作用,该作用可能与其抑制胃癌细胞和荷瘤小鼠VEGFA和VEGFC表达有关。
【图文】：

图 1-1 滋阴化痰方的成分-抗肿瘤靶点网络图nteraction networks of compounds -antitumor targets of ZYHesents compound of ZYHT and the blue circle represents the an滋阴化痰方潜在抗肿瘤靶点通路注释分析生物学信息注释数据库 DAVID，对滋阴化痰方所有潜在及信号通路分析进行展现和富集分析，得到滋阴化痰方的中包括对药物的反应、细胞迁移、细胞外基质的降解、血导的调节在内的 58 个生物学过程，详见表 1-3，图 1-2。表 1-3 滋阴化痰方潜在抗肿瘤靶点 GO 生物学功能分析结Term Count Ratresponse to drug 34 16.

图 1-2 滋阴化痰方潜在抗肿瘤靶点 GO 生物学功能分析结果Figure 1-2. Gene ontology analysis on potential effective anti-tumor targets of ZYHT滋阴化痰方富集的 KEGG 通路有 127 个，，其中有包括 HIF-1、TNF 信号通路、局部粘附（Focaladhesion）、黏着连接（Adherens junction）、VEGF 信号通路等在内的 46个 KEGG 通路有显著意义，详见表 1-4, 图 1-3。表 1-4 滋阴化痰方潜在抗肿瘤靶点 KEGG 通路分析ID Term Count Ratio P valuehsa05200 Pathways in cancer 46 22.12 1.21×10-17hsa05215 Prostate cancer 20 9.62 9.27×10-13hsa05219 Bladder cancer 14 6.73 2.15×10-11hsa04066 HIF-1 signaling pathway 19 9.13 4.74×10-11hsa04668 TNF signaling pathway 19 9.13 3.11×10-10hsa05205 Proteoglycans in cancer 25 12.02 4.48×10-10
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2598760