益气活血药通过调节自噬对心梗大鼠心室重塑的研究

发布时间：2020-03-25 19:58

【摘要】：研究目的:心肌梗死(MI)后心肌重塑的程度影响疾病的预后。自噬已被证明是心脏的一种适应性反应,但作为一种临床有效复方药物——益气活血药,在MI后的作用仍不清楚,因此我们对益气活血药是否通过自噬减轻MI后心肌重塑进行研究。本实验采用经典的左冠状动脉前降支结扎法建立大鼠缺血型心肌损伤模型——心梗模型;通过研究临床经验有效方——益气活血药,在MI后7天和28天对心肌自噬改变的情况,探讨益气活血药对损伤心肌的保护作用。其着重点在于心肌自噬的改变,实验过程中使用自噬抑制剂氯喹(CQ)观察自噬流的变化,最终观察益气活血药通过自噬流改变在心室重塑方面的作用以及相关机制的研究。研究方法:益气活血药在MI后第二天通过灌胃进行治疗。观察MI术后7天和28天后大鼠情况,同时使用自噬抑制剂CQ对自噬流进行观察。为了观察心室重塑和自噬在MI后术后7天和术后28天的发展,我们对冠状动脉结扎术后的心脏进行了分析。手术后24小时内存活的动物通过心电图随机分配给两个观察时间点:假手术组(S),模型组(M),益气活血药组(Y),培哚普利组(P),模型联合氯喹组(M+CQ),益气活血药联合氯喹组(Y+CQ),培哚普利联合氯喹(P+CQ)。CQ被认为通过提高溶酶体酸碱度从而抑制溶酶体细胞活性,由于自噬-溶酶体具有酸碱依赖性,碱化对溶酶体的影响是抑制融合和水解活性,从而防止自噬体清除。具体方法如下:(1)复制心肌梗死大鼠模型,运用心电图确定建模成功;(2)通过超声心动改变来评价心脏功能变化;(3)通过HE染色和Masson's染色,从组织形态学上观察梗死情况和心肌纤维化程度;同时通过检测心肌细胞肥大标志物ANP判断心肌肥大的影响。结合超声心动,从梗死大小、心肌肥大、心肌纤维化三方面综合判断益气活血药对心室重塑的改变情况;(4)运用临床较为适用的自噬抑制剂——氯喹(Chloroquine,CQ),进行动物心肌梗死后自噬观察的研究;检测自噬流相关蛋白Beclin1、p62、LC3,了解自噬动态过程的整体改变;运用透射电镜观察自噬情况,包括自噬体、线粒体、溶酶体以及整体情况,并通过自噬体计数来推测自噬活性程度。综合考虑,益气活血药对自噬流的影响;(5)运用免疫印迹法,观察自噬标记蛋白LC3、自噬-溶酶体相关蛋白CathepsinD的蛋白表达情况,了解自噬活性和降解情况;同时检测U ·biquitin,以判断泛素-蛋白酶体系的活性情况,了解蛋白降解整体情况。综合判断益气活血药在心梗后对蛋白降解的影响;(6)检测mTOR和4EBP1蛋白及磷酸化表达情况,判断益气活血药对mTOR途径的影响,揭示对心室重塑可能的机制;(7)以中医气血理论为指导,通过评价自噬情况与心脏结构、功能等变化的关系,进行综合分析,进一步探索心气和/或心气虚相关理论基础。研究结果:益气活血药治疗减轻MI后重塑,在MI术后7天上调自噬相关蛋白,并加速自噬的更新,在MI术后28天改善左心功能,使得心室重塑向良性方向发展。本实验各组干预在术后7天和术后28天,所有心梗模型术后大鼠的左心室收缩功能和舒张功能均降低,药物治疗组(包括Y、P、Y+CQ和P+CQ组)于术后28天各项指标较术后7天均有缓解,说明药物治疗具有改善心脏功能的功效。,本实验心脏射血分数(EF)、收缩期内径(LVIDs)和收缩期心室容积(LVESV)在术后28天组间可见显著性差异(P0.05),药物治疗各组(包括Y、P、Y+CQ和P+CQ组)对心脏功能均有改善,其中非抑制剂干预治疗组(包括Y、P组)效果最佳,而抑制剂干预治疗组(包括Y+CQ和P+CQ组)治疗效果略优于非治疗模型组,推测在疾病早期使用自噬抑制剂CQ对心脏功能有一定远期影响。检测心肌梗死边缘区组织ANP蛋白和基因表达,其中各组较S组均有统计学差异(P0.05),各药物干预组(包括Y、P、Y+CQ和P+CQ组)较之非药物干预模型组(包括M组和M+CQ组)表达降低。益气活血药对减轻MI后28天心肌肥大具有突出疗效。ANP蛋白和基因表达在各时期均上调,但术后7天较术后28天高,随着病程进展和治疗时间的推移而降低,心肌细胞随着病程进展则逐渐增大,而药物治疗具有抑制心肌细胞肥大的效果,其中益气活血药组抑制心肌细胞肥大具有突出疗效(P0.05)。非药物治疗的模型组(M组和M+CQ组)在MI术后7天和28天心肌细胞内自噬体数量增加,与S组对比具有统计学差异(P0.05),以术后7天最为显著;各药物治疗组(包括Y、P、Y+CQ和P+CQ组)在两个观察时间点与非药物治疗模型组相比,具有统计学差异(P0.05),但术后28天与S组相当,无统计学差异。从自噬体数量可见抑制剂CQ在术后7天确有抑制作用,主要抑制自噬体崩解,但不影响自噬体生成。行MI手术的大鼠心脏梗死边缘区,自噬体数量均增多,而非药物治疗的模型组(无论是否使用自噬抑制剂)的自噬体不仅数量上增多,且同一视野下可见自噬体多种形态(包含初始自噬体AVi和终末自噬体AVd)。推测药物治疗组不仅能上调自噬,同时能加速自噬更新。本实验中,所有行手术的大鼠(包括S组在内),在心肌受损后,自噬均被“启动”,术后7天,各组大鼠Beclin-1表达均上升,其中自噬抑制剂干预组(包括M+CQ、Y+CQ、P+CQ组)表达远高于未用抑制剂干预组,具有统计学差异(P0.05);术后28天,抑制剂干预各组趋于基础水平,与S组无异,而非抑制剂干预组中,Y组与P组同S组表达量相当,较M组表达量高,具有统计学差异(P0.05)。各组LC3B总表达量,在非抑制剂干预的治疗组(Y组和P组)均于术后7天上升,于术后28天恢复到基础水平;而抑制剂干预各组(包括M+CQ、Y+CQ、P+CQ组)在术后28天均低于S组,各组间无统计学差异。术后7天各组LC3B总表达量,与S组相比,Y组显著升高,P组次之,具有统计学差异(P0.05)。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值是自噬更新情况的代表,从免疫印迹结果可见,术后7天各组LC3转化为脂化型(LC3-Ⅱ)较术后28天多,其中Y组最明显,结合蛋白表达量分析,推测益气活血药在有效激活自噬上调同时也促进自噬的有效转化。术后28天使用抑制剂干预各组较S组低,具有统计学差异(P0.05),其原因可能是损伤早期由于自噬受到抑制,而出现的远期影响,其具体因素尚需进一步研究。各组p62表达在术后7天非抑制剂干预的治疗组(Y组与P组),较M组具有统计学差异(P0.05);抑制剂干预组中仅Y+CQ组较S组具有统计学差异(P0.05)。无论是否有自噬抑制剂的干预,各组于术后28天表达量均低于S组。各组CathepsinD于术后7天高表达,而术后28天表达同S组无统计学差异。术后7天,所有治疗组与相应模型组比较均有统计学差异(P0.05),其中Y组比M组低约40%,而P组较M组高30%,Y组与P组比较具有统计学差异(P0.05)。益气活血药对自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B、p62有不同程度的上调,而自噬溶酶体相关蛋白CathepsinD在益气活血药组的表达是众多组中最低的,自噬相关蛋白的上调、自噬溶酶体蛋白的表达相对较低,是自噬更新活跃的表现之一。各非抑制剂干预组中,mTOR表达以术后7天中Y组最高;术后28天的M+CQ组几乎不表达。术后7天,与S组相比,Y组与P组之间比较具有统计学差异(P0.05)。抑制剂干预各组于术后7天均低于S组50%,术后28天药物干预组(Y+CQ组和P+CQ组)较S组和M+CQ组表达低30%-40%,抑制剂干预的治疗组间在两个观察点间无统计学差异。两个观察点中,非抑制剂干预组的p-mTOR表达,均以M组表达较高,与S组相比具有统计学差异(P0.05),而治疗组与S组对比无统计学差异。抑制剂干预组中,术后7天仅M+CQ组较S组对比具有统计学差异(P0.05);术后28天各组明显升高,组间无统计学差异,但较S组对比具有统计学差异。4EBP1及其磷酸化蛋白p-4EBP1,在非抑制剂干预组中,仅P组p-4EBP1在术后28天较S组具有统计学差异,而其他各组之间无统计学差异。与之相相对应的抑制剂干预组则差异明显,其中4EBP1表达量在各抑制剂干预组之间均低于S组,具有统计学差异(P0.05)。p-4EBP1中,术后7天仅M+CQ组较S组具有统计学差异(P0.05),术后28天仅P+CQ组较S组具有统计学差异(P0.05)。本实验通过磷酸化蛋白与总蛋白的灰度比值,了解MI后各组相应通路的活化状态,通过p-mTOR/mTOR观察mTOR通路的活化情况,通过p-4EBP1/4EBP1观察mTOR通路下游通路活化情况。益气活血药对mTOR通路有抑制作用,当运用自噬抑制剂干预MI模型,则出现通路的激活状态。可见益气活血药在MI后术后7天提高自噬,激活自噬流并增加自噬更新。而自噬在术后28天恢复基础水平,而与蛋白质合成相关的信号通路p-mTOR/mTOR以及下游信号通路p-4EBP1/4EBP1则活跃。结合心脏功能改善情况综合考虑,益气活血药使得MI后心室重塑向良性方向发展。这一系列过程是通过mTOR途径调控相关信号对MI大鼠心室重塑的影响。Ubiquitin表达在非抑制剂干预的各组两个观察时间点,均无统计学差异;而运用抑制剂干预各组,在术后7天表达均低于S组,具有统计学差异(P0.05),而术后28天表达仅抑制剂干预治疗组具有统计学差异(P0.05)。Ubiquitin表达在非抑制剂干预的各组两个观察时间点,与S组表达差异不明显;而运用抑制剂干预的治疗组,两个观察点表达均低于S组。可以推测,Ubiquitin主要在术后28天较活跃,而术后7天的降解主要以自噬为主。为此,我们观察Ubiquitin、Cathepsin D与p62比值,从趋势图中可见,CathepsinD与p62比值在两个时间点均高于Ubiquitin。推测在MI后大鼠心脏组织中,蛋白质降解以自噬为主,以术后7天最显著,而UPS蛋白降解参与自噬“泛素化”阶段,术后28天的蛋白质降解,UPS与自噬均有,均在基础水平。结论:益气活血药提高自噬可能是减少心肌梗死后心脏重塑的一种治疗策略。1.益气活血药治疗的动物减轻心梗后重塑,在术后28天改善心功能,减缓射血分数降低,对左心室收缩末期直径、左心室终末期容积以及心肌细胞大小均较非治疗组较小。改善心功能效果与培哚普利相当,其中在改善心肌细胞肥大上益气活血药占优势。同时对心肌纤维化程度有改善。2.益气活血药上调术后7天,上调自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B、p62和自噬溶酶体蛋白Cathepsin D,提高自噬流并加速自噬更新。3.益气活血药在术后7天以蛋白质降解为主,抑制蛋白质合成;而在术后28天,以蛋白质合成为主,使得蛋白质合成与分解趋于平衡。4.益气活血药可能通过mTOR途径干预自噬并抑制蛋白质的合成,对mTOR及其下游蛋白质合成相关通路4EBP1在术后7天具有抑制作用,在术后28天则有上调作用,使得心肌梗死后心室重塑向良性方向发展。
【图文】：

射血分数,组间,药物治疗

逡逑射血分数（ＥＦ％）（表１，图１），术后７天和术后２８天，与Ｓ组相比，Ｍ组与Ｍ＋ＣＱ逡逑组均显著降低，具有统计学差异（Ｐ＜ａ0５）；术后７天和术后２８天，Ｍ组与Ｍ＋ＣＱ组间逡逑无统计学差异。逡逑术后７天，与Ｓ组相比，各药物治疗组（包括Ｙ、Ｐ、Ｙ＋ＣＱ和Ｐ＋ＣＱ组）于术后均逡逑下降，具有统计学差异0Ｐ＜０．0５）。与Ｍ组相比，Ｙ组与Ｐ组无统计学差异；与Ｍ＋ＣＱ逡逑组相比，Ｙ＋ＣＱ组与Ｐ＋ＣＱ组无统计学差异。Ｙ与Ｐ组间、Ｙ＋ＣＱ与Ｐ＋ＣＱ组间无统计逡逑学差异。逡逑术后２８天，与Ｓ组相比，各药物治疗组（包括Ｙ、Ｐ、Ｙ＋ＣＱ和Ｐ＋ＣＱ组）具有统计逡逑学差异（尸＜０．0５）。与Ｍ组相比，Ｙ组与Ｐ组较高，具有统计学差异（Ｐ＜０．０５）；与Ｍ＋ＣＱ逡逑组相比，Ｙ＋ＣＱ组与Ｐ＋ＣＱ组较高，具有统计学差异（ＰＨ）。Ｙ与Ｐ组间、Ｙ＋ＣＱ与逡逑Ｐ＋ＣＱ组间无统计学差异。逡逑从术后７天ＥＦ表达可以判断

内径,组间,药物治疗,左室舒张末内径

逑左室舒张末内径（ＬＶＩＤｄ）和左室收缩末内径（ＬＶＩＤｓ）在无药物干预的模型组中逡逑显著增大，尤以术后２８天为甚。（表１，图２）逡逑术后７天和术后２８天，与Ｓ组相比，Ｍ组与Ｍ＋ＣＱ组均升高，具有统计学差异逡逑0Ｐ＜ｆｔ０５）；术后７天和术后２８天，Ｍ组与Ｍ＋ＣＱ组间无统计学差异。逡逑术后７天，与Ｓ组相比，各药物治疗组（包括Ｙ、Ｐ、Ｙ＋ＣＱ和Ｐ＋ＣＱ组）均升高，逡逑具有统计学差异与Ｍ组相比，Ｙ组与Ｐ组无统计学差异；与Ｍ＋ＣＱ组相比，逡逑Ｙ＋ＣＱ组和Ｐ＋ＣＱ组无统计学差异。Ｙ与Ｐ组间、Ｙ＋ＣＱ与Ｐ＋ＣＱ组间无统计学差异。逡逑术后２８天，与Ｓ组相比，各药物治疗组（包括Ｙ、Ｐ、Ｙ＋ＣＱ和Ｐ＋ＣＱ组）均升高，逡逑具有统计学差异与Ｍ组相比，Ｙ组与Ｐ组，具有统计学差异ＣＰ＜ａ0５）；与逡逑Ｍ＋ＣＱ组相比，Ｙ＋ＣＱ组和Ｐ＋ＣＱ组无统计学差异。逡逑在术后２８天
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【相似文献】