薯蓣皂苷调控肺泡巨噬细胞自噬减轻矽尘所致肺部炎症和纤维化的机制研究

发布时间：2020-03-26 01:22

【摘要】：目的:职业性矽尘暴露可导致矽肺病,特征性表现为慢性炎症、组织修复异常和不可逆转的肺纤维化。由于矽肺发病机制仍不明确、有效的临床疗法尚待发现,寻找特异性分子靶点和经济有效的药物仍然是职业病防治工作中尚待解决的关键问题。肺泡巨噬细胞是矽肺发病过程中发挥核心调控作用的细胞之一。我们之前的研究曾证实天然单体——薯蓣皂苷可通过调节巨噬细胞主导的先天免疫反应而对矽肺治疗发挥积极作用,然而其具体分子机制有待进一步探索。本研究意在深入探讨薯蓣皂苷调控巨噬细胞影响矽尘所致肺部炎症和纤维化的可能机制,以期为矽肺治疗提供有效依据。研究方法:通过非暴露方式经气管灌注晶体二氧化硅建立实验性矽肺小鼠模型,应用Realtime-PCR和免疫印迹法,检测矽尘暴露早期(7天)和晚期(56天)实验性矽肺模型小鼠肺组织中自噬相关基因和蛋白变化情况;通过建立MH-S细胞体外矽尘暴露模型,并分别给予自噬激活剂或抑制剂,使用流式细胞术和TUNEL法,验证自噬对肺泡巨噬细胞凋亡的影响;用生物信息学软件预测薯蓣皂苷的可能生物效应,并通过构建LC3-GFP-mRFP转染巨噬细胞系,动态观察薯蓣皂苷对自噬的调控;同时在体内外矽尘暴露模型中,以免疫荧光、免疫印迹和凋亡检测等方法进一步证实薯蓣皂苷对自噬和凋亡的作用;通过薯蓣皂苷和自噬抑制剂联合作用,将薯蓣皂苷对自噬和凋亡的作用相互关联。上述实验用以说明薯蓣皂苷调控自噬对矽尘所致的肺泡巨噬细胞凋亡的效应。建立Atg5基因沉默MH-S细胞体外矽尘暴露模型和基因敲除鼠(Atg5~(flox/flox)Dppa3~(Cre/+))实验性矽肺模型,并从体内外途径进行薯蓣皂苷给药,通过免疫荧光和免疫组化法检测薯蓣皂苷对线粒体自噬的作用;采用mitoSOX~(TM)染色检测薯蓣皂苷通过调控自噬对线粒体ROS含量的影响;采用JC-1、TMRE、Rhodamine123染色检测薯蓣皂苷通过调控自噬对线粒体膜电位的影响;通过ATP检测衡量薯蓣皂苷通过调控自噬对线粒体功能的影响;通过检测细胞色素酶c和caspase3/7活性衡量薯蓣皂苷通过调控自噬对线粒体凋亡途径激活的影响。上述实验用以说明薯蓣皂苷调控自噬对矽尘所致的线粒体损伤的效应。ELISA和Realtime-PCR法检测在转录和分泌水平对MH-S细胞、肺泡巨噬细胞培养上清及BALF中细胞因子含量进行检测,同时以Realtime-PCR和免疫印迹法在基因和蛋白水平对MH-S细胞和肺组织中MMPs含量进行检测,用以薯蓣衡量皂苷通过调控自噬对巨噬细胞分泌细胞因子的影响;采用免疫组织化学染色和HE染色法观察薯蓣皂苷通过调控细胞自噬对肺组织炎症的影响;通过Realtime-PCR和天狼星红染色等方法检测胶原沉积情况,从而衡量薯蓣皂苷诱导的自噬对矽肺纤维化的影响。上述实验用以说明薯蓣皂苷调控自噬对矽尘所致的炎症和纤维化的效应。结果:1、矽尘暴露小鼠肺组织中自噬增强免疫印记法和Realtime-PCR法检测矽尘暴露早期和晚期肺组织中自噬相关蛋白在蛋白水平和基因水平的表达情况。结果显示,在矽尘暴露早期和晚期,实验组小鼠肺组织中表达LC3II、ATG5、BECN1和P62蛋白水平均有增高(P0.05);自噬相关基因的表达在两个时间点也有所增加,早期的P62和晚期的Atg5、ULK1及P62基因的变化具有统计学意义。2、促进自噬可减轻矽尘诱导的肺泡巨噬细胞凋亡运用流式细胞术和TUNEL法检测矽尘暴露环境中单独或联合给予自噬激活剂、自噬阻断剂和薯蓣皂苷的MH-S细胞的凋亡情况。结果显示,抑制自噬可以增加矽尘所致的MH-S细胞凋亡,促进自噬可以降低矽尘所致的MH-S细胞凋亡(P0.05)。3、薯蓣皂苷通过促进肺泡巨噬细胞自噬减轻细胞凋亡凋亡实验结果显示,给予薯蓣皂苷可以降低细胞凋亡水平,而当薯蓣皂苷和自噬抑制剂一同给予时,薯蓣皂苷不能降低细胞凋亡水平。激光共聚焦显微镜观察到给予薯蓣皂苷可以促进MH-S细胞内的自噬流;免疫印迹法结果显示,相较实验组,实验给药组MH-S细胞的LC3II、BECN1蛋白表达水平增高,P62蛋白表达水平降低,且具有剂量效应关系(P0.05);实验给药组MH-S细胞AKT/mTOR通路磷酸化水平显著降低,且具有剂量效应关系(P0.05)。免疫印迹法和免疫荧光法分别检测薯蓣皂苷给药矽肺模型小鼠肺组织和肺泡巨噬细胞中自噬变化情况:在矽尘暴露的早期和晚期,相较实验组,实验给药组小鼠肺组织和肺泡巨噬细胞的LC3II、BECN1蛋白表达水平增高,P62蛋白表达水平降低,且具有统计学意义(P0.05);实验给药组小鼠肺泡巨噬细胞中LC3蛋白荧光表达增加,P62蛋白荧光表达减弱。流式细胞术和TUNEL法检测原代肺泡巨噬细胞的结果显示,在两个时间点,薯蓣皂苷给药均可降低矽尘诱导的肺泡巨噬细胞凋亡(P0.05)。4、薯蓣皂苷促进肺泡巨噬细胞的线粒体自噬免疫印迹法结果显示,薯蓣皂苷可以促进MH-S细胞自噬相关蛋白LC3II、BECN1的表达,减少P62蛋白的表达;同时,薯蓣皂苷可以促进线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin的表达,而薯蓣皂苷的作用可以被Atg5基因沉默逆转。免疫荧光结果显示,实验给药组细胞中的自噬小体标记物LC3(红)和自噬小体与线粒体标记物重合点(黄)的表达均高于实验组细胞。5、薯蓣皂苷通过调控自噬保护线粒体功能使用流式细胞仪和荧光显微镜检测肺泡巨噬细胞中线粒体ROS的表达情况。结果显示,薯蓣皂苷给药可以缓解矽尘诱导的线粒体ROS高表达,而在Atg5基因沉默细胞中这种作用消失(P0.05)。我们用JC-1探针检测线粒体膜电位,观察到薯蓣皂苷以自噬依赖的方式保护线粒体膜电位,减少矽尘造成的线粒体膜电位降低(P0.05)。用TMRE和Rhodamine123染色法检测线粒体通透性,实验结果显示,薯蓣皂苷会通过促进自噬减轻矽尘造成的线粒体膜通透性增加。采用检测细胞内ATP含量的方法来衡量线粒体功能,薯蓣皂苷可以增强线粒体功能,Atg5基因沉默可以逆转薯蓣皂苷的作用(P0.05)。通过获取Atg5~(flox/flox)Dppa3~(Cre/+)小鼠矽肺模型肺泡灌洗液中的巨噬细胞,我们检测体内途径薯蓣皂苷给药对线粒体功能的影响。与体外途径给药实验结果相似,薯蓣皂苷可以减少矽尘造成的肺泡巨噬细胞的线粒体ROS高表达、线粒体膜电位降低、线粒体通透性增加和线粒体功能降低,而薯蓣皂苷的这一系列作用无法在自噬缺陷的Atg5~(flox/flox)Dppa3~(Cre/+)小鼠肺泡巨噬细胞中发挥作用(P0.05)。6、薯蓣皂苷抑制线粒体凋亡途径的激活使用免疫荧光法检测线粒体凋亡关键蛋白细胞色素酶c的分布,我们观察到矽尘可造成细胞色素酶c的荧光强度增加并广泛分布于细胞质中,薯蓣皂苷可以限制细胞色素酶的分布,Atg5基因沉默可以逆转薯蓣皂苷的作用。Caspase 3/7活性检测的结果显示,薯蓣皂苷可以减轻矽尘诱导的细胞内Caspase 3/7活性增加,Atg5基因沉默可以逆转薯蓣皂苷的作用(P0.05)。7、薯蓣皂苷通过促进自噬降低肺泡巨噬细胞因子的分泌ELISA法检测MH-S细胞培养上清中细胞因子的分泌水平,结果表明,薯蓣皂苷可以显著降低矽尘所致的MH-S细胞分泌IL-1β、IL-6和MCP-1水平,而Atg5基因沉默和BECN1基因沉默均可以逆转薯蓣皂苷的此种作用(P0.05)。Realtime-PCR法和ELISA法在转录和翻译水平检测薯蓣皂苷给药矽肺模型小鼠肺泡巨噬细胞分泌细胞因子的水平。结果显示,薯蓣皂苷可以显著降低肺泡巨噬细胞Il-1β、Il-6和Mcp-1基因的表达和因子的分泌,且都具有统计学意义。而在自噬缺陷的Atg5~(flox/flox)Dppa3~(Cre/+)小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6和MCP-1的分泌水平不会因给予薯蓣皂苷而降低(P0.05)。8、薯蓣皂苷通过促进自噬降低肺泡巨噬细胞基质金属蛋白酶的分泌免疫印迹法检测MH-S细胞中的MMPs的表达水平,结果表明,薯蓣皂苷可以显著降低矽尘刺激下MH-S细胞分泌MMP9和MMP12的水平,而Atg5基因沉默可以逆转薯蓣皂苷的此种作用(P0.05)。Realtime-PCR法和免疫印迹法在基因和蛋白水平检测薯蓣皂苷给药矽肺模型小鼠肺组织中MMPs的表达水平。结果显示,薯蓣皂苷可以显著降低Mmp9和Mmp12基因的转录和蛋白的表达,均有统计学意义。而在自噬缺陷的Atg5~(flox/flox)Dppa3~(Cre/+)小鼠肺组织中Mmp9和Mmp12基因转录水平不会因薯蓣皂苷的给予降低,而模型组Mmp9和Mmp12基因转录水平比Atg5~(flox/flox)Dppa3~(+/+)小鼠更高(P0.05)。9、薯蓣皂苷通过促进自噬延缓矽肺炎症和纤维化免疫组织化学法检测巨噬细胞在组织中的聚集情况,我们观察到薯蓣皂苷可以显著降低矽尘造成巨噬细胞标记F4/80的增加。HE染色检验炎细胞浸润和炎症损伤情况,我们观察到薯蓣皂苷可以显著缓解矽尘造成肺组织损伤,而薯蓣皂苷不能缓解矽尘引起的Atg5~(flox/flox)Dppa3~(Cre/+)小鼠的肺组织炎症。Realtime-PCR法和天狼星红染色检验胶原沉积情况,实验结果表明,薯蓣皂苷可以显著缓解矽尘引起的Col1a1和Col3a1基因转录增加(P0.05)和Ⅰ型和Ⅲ型胶原的的表达。结论:薯蓣皂苷通过促进肺泡巨噬细胞自噬,增强对矽尘损伤线粒体的清除、减轻线粒体介导凋亡通路的激活,进而使肺泡巨噬细胞抵抗矽尘所致的凋亡,从而减少细胞内过量的线粒体ROS产生和巨噬细胞促炎促纤维化因子分泌,以缓解矽尘所致的肺部炎症和纤维化。
【图文】：

变化情况图,矽尘,自噬,小鼠

16图 3.1 矽尘暴露小鼠肺组织中自噬相关基因和蛋白的变化情况A：免疫印迹法检测矽尘暴露早期和晚期各组小鼠肺组织内 LC3II，BECN1，ATG5 和 P62 的变化情况。B：矽尘暴露早期 LC3II，BECN1，ATG5 和 P62 蛋白表达水平统计图（n=3）。C：矽尘暴露晚期 LC3II，BECN1，ATG5 和 P62 蛋白表达水平统计图（n=3）。D：Realtime-PCR 检测矽尘暴露早期各组小鼠肺组织中 BECN1，Atg5，Atg7，Ulk1 和 P62mRNA 的变化情况（n=5）。E：Realtime-PCR 检测矽尘暴露晚期各组小鼠肺组织中 BECN1，Atg5，，Atg7，Ulk1 和 P62mRNA的变化情况（n=5）。*，P㩳0.05；**，P㩳0.01。实验结果表示为均数±标准误（mean±SEM）。

薯蓣皂苷,蛋白,自噬,矽肺病

中国医科大学博士学位论文进 MH-S 细胞自噬可减轻矽尘所致细胞凋亡巨噬细胞在矽肺病程中起关键作用。我们的早期研究发现，矽肺自噬活动发生改变[21]。细胞自噬与细胞凋亡密切相关[22]，而肺泡影响矽肺病的发生发展[23]。为进一步探究自噬在肺泡巨噬细胞凋引入肺泡巨噬细胞系 MH-S，在给予矽尘（CS,50μg/cm2）模拟暴噬诱导剂——雷帕霉素（Rapamycin）、自噬抑制剂——3MA、Co)单独或联合处理细胞后检验凋亡情况。生物信息学分析表明，薯噬过程（图 3.2），且前期研究证实其对矽肺有治疗作用，我们假药物。几种药物的用量均经过 MTT 实验和 PI-Annexin V 实验验力和凋亡（图 3.3）。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

【相似文献】