基于在体单向肠灌流与Caco-2细胞模型的四制香附主成分的肠吸收机制研究

发布时间：2020-03-28 08:41

【摘要】：目的:基于在体单向肠灌流与Caco-2细胞模型研究四制香附主成分(香附烯酮、α-香附酮)的肠吸收机制,为四制香附的临床应用及剂型设计提供科学依据。方法:1.Caco-2细胞模型的建立与评价通过观察细胞形态、测定碱性磷酸酶(AKP)的活性、测量跨膜电阻(TEER)值、荧光素钠标记物渗透量检测,评价Caco-2体外细胞单层模型是否建立成功。2.四制香附提取物及其主成分的细胞毒性评价通过MTT细胞毒性实验,计算不同质量浓度四制香附石油醚部位、香附烯酮、α-香附酮及混合物(香附烯酮+α-香附酮)溶液的细胞存活率,以≥90%的细胞存活率对应的给药浓度为安全浓度,确定药物的安全浓度。3.Caco-2细胞模型研究四制香附主成分肠吸收机制采用HPLC-MS/MS测定转运实验样品中香附烯酮和α-香附酮的含量。考察时间、浓度、EDTA、P-gp抑制剂、MRP2抑制剂对香附烯酮和α-香附酮在Caco-2细胞模型的跨膜转运的影响,并考察香附烯酮与α-香附酮配伍前后在Caco-2细胞模型的正向转运特性。4.在体单向肠灌流模型研究四制香附主成分肠吸收机制采用HPLC测定肠灌流样品中香附烯酮和α-香附酮的含量。考察不同肠段、浓度、EDTA、P-gp抑制剂对香附烯酮和α-香附酮肠吸收的影响,并考察四制香附石油醚部位模拟体系和四制香附石油醚部位体系对香附烯酮、α-香附酮肠吸收的影响。结果:1.生长至21天后,细胞排列紧密,无缝隙;AP/BL侧碱性磷酸酶活性比约为8,表明细胞可以产生极化;Caco-2单层细胞TEER值均大于600Ω·cm~2;标示物荧光素钠的P_(app)值为(2.60±0.17)×10~-77 cm·s~(-1),小于10~-66 cm·s~(-1),表明细胞完整性良好。2.细胞毒性实验表明,药物溶液中甲醇含量不得超过2%;四制香附石油醚部位安全浓度为2.98~46.45μg·mL~(-1);香附烯酮安全浓度为3~90μg·mL~(-1);α-香附酮安全浓度为3~120μg·mL~(-1);香附烯酮与α-香附酮以1:2、1:3的比例配伍(各比例中α-香附酮浓度保持30μg·mL~(-1)不变)给药4 h后,细胞的存活率均大于90%。3.香附烯酮、α-香附酮的转运量具有浓度和时间依赖性,其P_(app)值均大于1×10~-66 cm·s~(-1),外排率均在0.5~1.5;加入EDTA、维拉帕米、MK-571后,香附烯酮和α-香附酮的P_(app)和ER值没有明显改变;配伍后,香附烯酮和α-香附酮AP-BL侧的P_(app)值均显著增加。4.香附烯酮与α-香附酮在整个肠段均易吸收,其中香附烯酮在回肠吸收最好,α-香附酮在空肠吸收最好;在一定质量浓度范围内,香附烯酮、α-香附酮的吸收参数K_a和P_(eff)值无显著性差异,其P_(eff)值均大于1.2×10~(-3)/cm·min~(-1);维拉帕米及EDTA的存在并没有明显改善香附烯酮与α-香附酮肠吸收;与单体比较,四制香附石油醚模拟体系和四制香附石油醚部位体系中的α-香附酮和香附烯酮吸收参数K_a和P_(eff)值均有显著性差异。结论:本课题通过两种肠吸收模型研究发现,香附烯酮与α-香附酮的肠吸收机制以被动扩散为主,不经细胞旁路转运,不受P-gp的影响。Caco-2细胞模型研究发现,香附烯酮与α-香附酮跨膜转运不受MRP2的影响,且香附烯酮与α-香附酮之间可能存在协同作用。在体单向肠灌流模型研究发现,香附烯酮与α-香附酮的肠吸收存在协同作用,四制香附石油醚部位中其他成分与香附烯酮、α-香附酮成分的肠吸收可能存在协同作用。
【图文】：

示意图,示意图,游离酚,孔板

图 1-1 Caco-2 细胞单层示意图Fig.1-1 Caco-2 cell monolayer mode2.2 Caco-2 细胞模型的评价2.2.1 Caco-2 细胞形态[17]细胞按 2×105/mL 密度接种于 12 孔板中，用培养液培养，常规培养 21 天后，用倒置显微镜观察细胞形态，并进行拍照。2.2.2 碱性磷酸酶的活性测定[18]采用碱性磷酸酶（AKP）测试盒来检测细胞两侧碱性磷酸酶的活性，其作用机制是碱性磷酸酶可以把磷酸苯二钠分解，分解后的产物是游离酚和磷酸，游离酚在碱性条件下与4-氨基安替吡啉反应后，经铁氰化钾氧化成红色醌衍生物。因此，可以用红色深浅来判断碱性磷酸酶活力的高低。Caco-2 细胞在 12 孔板中生长至 5，13，21 天，用 HBSS 缓冲液（pH=7.4

细胞形态,碱性磷酸酶活力,生长阶段

图 1-3 Caco-2 细胞形态图ptical microscope photo of Caco-2 cells cultiv的活性间的细胞单层的碱性磷酸酶的活性结果见表活力比 (AP/BL) 随时间的增加而增长，到第明碱性磷酸酶的分布非常不对称，，出现了明生长阶段 Caco-2 细胞单层碱性磷酸酶活力ctivity of Caco-2 cells monolayer at different growt时间（t/d）碱性磷酸酶活力5 1.249±0.013 3.602±0.2
【学位授予单位】：江西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R283.6;R285

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