长白山人参水煎液中microRNA测序分析及其对气虚疲劳大鼠模型部分基因表达的影响

发布时间：2020-03-29 07:34

【摘要】：目的:验证长白山人参水煎液中miRNA是否存在;验证空白组(正常大鼠)和处理组(灌胃人参水煎液)大鼠血液中人参miRNA的表达变化;通过建立气虚疲劳大鼠模型,验证人参miRNA对其靶基因的影响。方法:1.选用通用植物miRNA提取试剂盒法抽提人参水煎液miRNA,经琼脂糖凝胶、Agilent2100 Bioanalyzer检测其质量、纯度、完整性。并利用Illumina HiSeq ~TMM 2500测序仪对人参水煎液进行测序分析,预测其中是否存在已知miRNA以及新的miRNA,以及利用RT-qPCR技术验证已知miRNA。2.6只大鼠分成2组(空白组和处理组),每组各3只,除正常组外,处理组灌胃2次/天,灌胃体积均为1ml/100g,连续给药30天。第31天,不给药,取各组血液,采用HiPure Liquid RNA/miRNA Kit试剂盒进行血液RNA的提取,利用RT-qPCR技术检测验证大鼠血液中含有的人参miRNA,以及通过生物信息学方法将测序得到的人参煎液中miRNA比对大鼠进行靶基因分析筛选。3.60只大鼠分成6组(人参水煎液组-R、去人参miRNA组-Q、人参miRNA组-M、人参皂苷组-Z、PBS组-P和空白组-K),每组10只,采用饮食失节+力竭游泳方法制造气虚疲劳大鼠模型,连续20天。第21天,给药,不游泳,取各材,测血清BUN、LDH和肝糖原的含量。并观测各组药物对大鼠的影响,通过RT-qPCR验证人参miRNA是否影响气虚疲劳大鼠免疫基因的表达变化。结果:1.利用琼脂糖凝胶和Agilent2100 Bioanalyzer检测,人参水煎液能有效提取miRNA。通过测序,最终鉴定人参煎液有71个miRNA家族。利用RT-qPCR验证人参水煎液中miR159、miR167、miR396、miR166、miR168、miR156、miR165、miR162、miR394均存在并表达量降低。2.利用RT-qPCR技术进一步地验证大鼠血液中确实存在人参miRNA,如miR159、miR167、miR393、miR156、miR8175、miR5072等。并通过靶基因预测的相关软件分析,发现人参中的部分miRNA对大鼠部分基因能够达到高度匹配。如miR159与Mmp9,miR167与Bcl2l1,miR8175与Il4r,miR5072与Bcl2,miR158与Mapk14等。3.通过各项指标验证,发现本实验成功建立气虚疲劳大鼠模型。给予各组药物后,RT-qPCR验证得出人参miRNA组大鼠体内的免疫基因表达量有明显变化,人参miRNA能够影响INF-8、IL10、MMP9、IL4R、MARK14、TNF-α、BCL2L1 mRNA的表达,其可能影响多条免疫应答信号转导通路,进而调节多种细胞因子的表达来防治气虚证。结论:初次证实人参煎液中miRNA的存在,以及人参miRNA对气虚疲劳大鼠机体免疫基因的调节作用,为我们提供了认识和研究人参的新途径。从基因的层面深入揭示中医药疗效的作用机制,同时也影响人参类新药、保健品及相关用品的研究与开发。
【图文】：

实验材料,五加,水煎液

山人参水煎液 miRN成过程中两端往往会被甲的影响。本部分实验对新croRNA 快速提取试剂盒进RNA，并利用高通量测序对参植株购自清平中药材市鸿雁副教授鉴别为五加

序列,实验流程,高通量,测序

图 2-2 实验流程图 miRNA 高通量测序后的生物信息学分析学分析是经过高通量测序后的必备步骤，本部分将对整准信息分析，，并预测 miRNA 的靶基因富集分析。标准个模块:先，对测序得到的原始数据进行处理，从而得到小 RN后，对获得的小 RNAtag 序列进行注释分析，通过注释NA 的 tag 序列组成，从而鉴定出 mirna。后，分析 miRNA 表达谱对靶基因的富集、对 miRNA 对靶基因预测进行分析。其流程如下（见图 2-3）：
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5;R-332

【参考文献】