靶向CCR5受体的抗HIV中药及抗体筛选方法的初步建立

发布时间：2020-03-29 14:54

【摘要】：背景:艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征(AIDS,Acquired Immune Deficiency Syndrome),是一种由于感染I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1,Human Immunodeficiency Virus type 1)导致机体免疫功能完全丧失的传染性疾病。国家卫生与计划生育委员会的数据显示,2016年我国现存AIDS患者约62万人,这为公众健康以及社会稳定带来了巨大的隐患。AIDS的治疗一直是世界性的难题。目前临床上主要使用逆转录抑制剂、整合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等,但是当前的治疗方法不能完全消灭病毒治愈艾滋病。并且当前的抗病毒治疗容易产生耐药性和严重的毒副作用限制了其发展,因此研制安全有效的HIV-1疫苗是HIV的预防和控制新的方向。HIV-1病毒具有高突变和基因重组多样的特点,HIV疫苗的研究面临巨大的困难与挑战。CCR5(The C-C chemokine receptor type 5)受体是临床现有HIV-1毒株必不可少的共受体之一,是导致全球HIV-1病毒株传播的主要共受体,使得它可以作为抗病毒治疗的重要靶点。CCR5作为宿主细胞中的固有受体,在HIV感染中发挥重要作用并且保守性较强,十分适合作为抗HIV-1研究的切入点。本研究中针对CCR5受体主要做了两方面的工作,一方面通过添加中药提取物至稳定表达CCR5的细胞系中,利用流式细胞术检测CCR5蛋白在药物作用下的表达情况,从而判断体外添加中药提取物对CCR5受体的作用以及抗HIV-1的活性;另一方面主要采用哺乳动物双杂交系统,研究抗HIV-1中和抗体PRO140与宿主细胞CCR5基因的相互作用,为进一步的作用于CCR5分子抗体的筛选和研究打下基础。目的:研究体外状态下中药提取物对CCR5蛋白表达的影响,从而判断该中药是否具有潜在的抗HIV-1活性;构建含有中和抗体基因的质粒pVP16-PRO140,将重组质粒与含有CCR5的质粒共转染到CHO细胞中,通过检测报告基因来分析,两个蛋白是否有相互作用,为进一步抗体方面的研究打下基础。方法:1.添加中药提取物至稳定表达CCR5蛋白的细胞系,使用流式细胞术检测CCR5表达受到中药提取物的影响情况。2.采用质粒提取、酶切、胶回收的方法获取目的片段PRO140,并将其插入载体pVP16内,构建重组质粒p VP16-PRO140,通过菌落PCR、酶切电泳分析及测序的方法对重组质粒进行验证。3.同样采用分子克隆的方法构建重组质粒pM-CCR5,并应用脂质体转染CHO细胞。将重组质粒pM-CCR5及空载体pM转染入CHO细胞中,然后使用Western Blot的方法从蛋白水平检测CCR5基因的表达。4.通过哺乳动物双杂交系统,共转染质粒pVP16-PRO140和质粒pM-CCR5以及报告基因到CHO细胞中。5.使用分泌型碱性磷酸酶检测来鉴定PRO140抗体与CCR5受体之间相互作用效果。结论:1.在体外实验中,中药提取物穿心莲内酯和槲皮素均可以不同程度的抑制CCR5蛋白的表达,而芦丁、白术等提取物对CCR5蛋白的表达无明显作用。2.初步构建哺乳动物双杂交系统,并验证了CCR5蛋白与单链抗体PRO140的相互作用,证明该系统可以用于检测CCR5蛋白与目标蛋白是否有相互作用,进行靶向CCR5受体的抗体药物的筛选。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

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本文编号：2606125