朱砂和其他含汞化合物肾脏的摄入和外排差异比较研究

发布时间：2020-03-30 16:10

【摘要】：目的:探索朱砂与HgS、HgCl_2、MeHg肾脏的摄入和外排的差异。方法:1、建立UPLC-ICP/MS定量分析方法,以检测HEK 293T细胞内外无机汞和甲基汞含量变化。2、HEK 293T细胞种于96孔板中,设置空白对照组、HgCl_2组(0.2μM)、MeHg组(0.2μM)、HgS组(0.2μM)、朱砂组(0.2μM)5个实验组,每组6孔。各供试品经前处理后,分别与细胞孵育48h后,在避光条件下加入20μL MTT,4h后小心吸出上清后加入150μL DMSO,在490 nm波长处检测吸光度值。3、HEK 293T细胞种于6孔板中,设置空白对照组、HgCl_2组(0.2μM)、MeHg组(0.2μM)、HgS组(0.2μM)、朱砂组(0.2μM)5个实验组,每组6孔。各供试品经前处理后,分别与细胞孵育24h、36h、48h后,用PBS清洗并轻轻吹打细胞后收集于2 mL离心管中,室温下179×g,离心3 min。重复以上操作两次后,收集细胞内汞样本(加入2 mL 0.3%Triton X-100,常温下静置10 min后,取出),检测细胞内汞含量。4、HEK 293T细胞种于6孔板中,设置空白对照组、HgCl_2组(0.2μM)、MeHg组(0.2μM)、HgS组(0.2μM)、朱砂组(0.2μM),每组6孔。各供试品经前处理后与细胞孵育48h后,用PBS清洗3次,加入含9%胎牛血清DMEM高糖培养基再继续分别培养24h、36h(共孵育培养72h、84h)。收集细胞外液(即培养基),检测细胞外汞含量。5、将HEK 293T细胞接种于6孔板中,设置空白对照组、HgCl2组(0.2μM)、MeHg组(0.2μM)、HgS组(0.2μM)、朱砂组(0.2μM),每组6孔。各供试品经前处理后与细胞分别孵育24h、36h、48h,用PBS清洗三次后,每孔加入1 mL Trizol裂解细胞。同样将HEK 293T细胞接种于6孔板中,设置空白对照组、HgCl2组(0.2μM)、MeHg组(0.2μM)、HgS组(0.2μM)、朱砂组(0.2μM),每组6孔。各供试品经前处理后与细胞孵育48h后,用PBS清洗3次后,每孔加入1 mL Trizol裂解细胞。用Real-Time PCR法检测肾脏转运体mRNA的表达。结果:1、建立了快速、准确、灵敏的UPLC-ICP/MS定量分析检测方法,可以满足检测细胞内外无机汞以及甲基汞浓度变化的要求。2、给予同等摩尔质量的氯化汞、甲基汞、硫化汞、朱砂(0.2μM)后,MTT实验表明细胞存活率分别为90.97%,90.32%,91.88%,91.45%。3、细胞内汞实验表明,24h细胞内氯化汞组中无机汞含量为0.48%(占加入量的百分比),而硫化汞、朱砂组中无机汞的含量则低于0.039μg/L(定量下限为0.039μg/L)。甲基汞组中有机汞含量为8.43%(占加入量的百分比),而24h细胞内硫化汞和朱砂组中有机汞的含量则低于0.039μg/L(定量下限为0.039μg/L)。36h细胞内氯化汞组、硫化汞组、朱砂组中无机汞含量分别为2.41%、1.58%、0.36%(占加入量百分比)。甲基汞组、硫化汞组、朱砂组中有机汞的含量为10.31%、0.77%、0.14%(占加入量百分比)。48h氯化汞组、硫化汞组、朱砂组中细胞内无机汞的含量为3.00%、2.40%、2.20%(占加入量百分比)。48h细胞内甲基汞组、硫化汞组、朱砂组中有机汞的含量为15.38%、0.79%、0.19%(占加入量百分比)。结果表明,随着时间的增加,朱砂组和硫化汞组细胞内汞无机汞含量不断增加,并在48h时达到高峰且其入胞速度远低于氯化汞和甲基汞组。4、细胞外汞实验表明,24h(共孵育培养72h)细胞外氯化汞组、硫化汞组、朱砂组中无机汞的含量为68.28%、74.01%、81.35%(占细胞内汞含量百分比)。24h细胞外甲基汞组、硫化汞组、朱砂组中有机汞的含量为63.55%、1.06%、1.14%(占细胞内汞含量百分比)。36h(共孵育培养84h)细胞外氯化汞组、硫化汞组、朱砂组中无机汞的含量为71.80%、81.17%、89.02%(占细胞内汞含量百分比),84h细胞内甲基汞组、硫化汞组、朱砂组中有机汞的含量分别为66.96%、1.34%、1.40%(占细胞内汞含量百分比)。结果表明,在84h时朱砂组无机汞的外排含量最多。5、在24h、36h以及48h时朱砂组、硫化汞组、氯化汞组以及甲基汞组对摄入转运体Cnt2以及Octn1的m RNA几乎没有影响。在72h时硫化汞和朱砂组组使Mdr1的mRNA的表达显著增加,朱砂组和硫化汞组分别在72h和48h时使Mrp2的mRNA水平增高。而甲基汞组和氯化汞组对Mrp1、Mrp2、Mrp4 mRNA水平几乎没有影响。结论:1、朱砂和其他含汞化合物的转运不同,且其入胞速度远低于HgCl_2和MeHg,出胞速度较HgCl_2和MeHg快。2、HgS和朱砂的外排可能与肾脏转运体Mdr1、Mrp2有关。
【图文】：

色谱图,甲基汞,无机汞,朱砂

17图 1 细胞内汞无机汞和甲基汞色谱图 (A：空白组 B：标准品溶液 C: 朱砂组 D: 硫化汞组 E：氯化汞组 F: 甲基汞组，1：无机汞、2：甲基汞、3：金）Fig. 1 Representive chromatograms of inorganic mercury and methyl mercury in cellsamples(A: the blank group, B: the standard control group, C: the cinnabar group, D: themercuric sulfide group, E: the mercuric chloride group, F: the methyl mercury group, 1:Methyl mercury, 2: Inorganic mercury, 3: Au )

曲线,无机汞,甲基汞,标准曲线

硕士学位论文准曲线的制备为横坐标，峰面积纵坐标，计算回归方程；细胞内0 μg/L 范围标准曲线：y=39312.5656 x+1700.5078，r=0.92.500 μg/L 范围标准曲线：y=18657.4264 x+ -645.4927，，r=浓度范围内线性关系良好。如图 3 所示：
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】