【摘要】：目的本课题以麻黄、桂枝为研究对象,通过研究麻黄、桂枝以及两药配伍对KM小鼠行为学改变,大脑组织形态学改变,脑组织神经递质、氧化应激因子、NLRP3炎症因子蛋白的变化来探讨桂枝拮抗麻黄中枢毒性作用的研究。本课题从药效学角度观察了桂枝对麻黄所致小鼠中枢兴奋性毒性的抑制作用,同时也探究了桂枝拮抗麻黄中枢多巴胺神经元毒性的作用机制。方法40只KM小鼠按体重随机分为生理盐水组、麻黄组(10g/kg)、麻黄-桂枝3:2组(10g/kg+6.67g/kg)、麻黄-桂枝3:1组(10g/kg+3.33g/kg)、桂枝组(6.67g/kg),每组8只,各组小鼠每天灌胃(ig)给药1次,每次给药容积为0.2ml/10g,连续14天。于第7天进行旷场实验,第12、13天进行避暗实验,各组小鼠末次给药1h后脱颈椎处死取大脑,在冷冻的磷酸盐缓冲液(PBS)中漂洗,迅速将大脑切分为左右两半,取小鼠左半脑用相同方法切分成两份,分别用锡箔纸包好存放于液氮中,小鼠右半脑固定在4%多聚甲醛中,备用。1.行为学检测:实验给药第7天晚上进行旷场实验,将小鼠放入旷场反应箱适应5s后观察并记录小鼠5min内静止时间、运动时间以及运动路程。实验给药第12天晚上进行第一次避暗实验,将小鼠放入避暗箱适应5s后,按照流程开始实验。24h后重复实验观察并记录小鼠5min内第一次进入暗室被电击的时间(即潜伏期)以及总共电击次数(即错误次数);2.HE染色观察小鼠脑组织结构损伤:将4%多聚甲醛固定液中小鼠脑组织海马、皮层与纹状体部位分离,常规石蜡包埋,4μm切片,HE染色,显微镜下观察小鼠脑组织海马、皮层与纹状体病理损伤变化;3.多巴胺神经递质水平变化:采用免疫组化法检测小鼠大脑海马、纹状体、皮层中多巴胺(DA)、多巴胺转运体(DAT)含量;4.氧化应激水平检测:采用化学法按照试剂盒说明书测定脑组织中超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)含量;5.NLRP3炎症小体检测:采用免疫印迹法(Western blot)测定脑组织Nod样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)蛋白表达。结果1.麻黄桂枝配伍对KM小鼠旷场实验、避暗实验的影响旷场实验:与生理盐水组相比,麻黄组小鼠自主活动明显增加,表现为静止时间降低,运动的时间增加,平均运动距离增加,均具有显著的统计学意义(P0.01),桂枝组与生理盐水组差异不明显,无统计学意义(P0.05);与麻黄组相比,麻黄-桂枝3:2组自主活动明显降低,表现为小鼠静止时间增加,运动时间降低,平均运动降低,且具有显著的统计学意义(P0.01),麻黄-桂枝3:1组小鼠自主活动降低,具有统计学意义(P0.05)。避暗实验:与生理盐水组相比,麻黄组小鼠潜伏期明显缩短(P0.01),错误次数明显增加(P0.01),且具有显著的统计学意义,桂枝组与生理盐水组差异不明显,无统计学意义(P0.05);与麻黄组相比,麻黄-桂枝3:2组潜伏期延长(P0.01),错误次数降低(P0.01),具有显著的统计学意义。麻黄-桂枝3:1组小鼠潜伏期延长(P0.05),错误次数降低(P0.05),具有统计学意义。2.麻黄桂枝配伍对KM小鼠海马、纹状体、皮层多巴胺神经递质表达的影响与生理盐水组相比,麻黄组小鼠大脑海马、纹状体、皮层DA、DAT表达明显减少,平均光密度值显著降低,且具有显著的统计学意义(P0.01),桂枝组DA、DAT表达差异不明显,无统计学意义(P0.05);与麻黄组相比,麻黄-桂枝3:2组、3:1组不同部位DA、DAT表达显著升高,且具有显著的统计学意义(P0.01),其中3:2组升高更为明显。3.麻黄桂枝配伍对KM小鼠海马、纹状体、皮层病理形态学的影响光镜下生理盐水组海马区锥体细胞排列整齐,锥体细胞的数量和厚度未见异常,无神经细胞坏死和小胶质细胞增生等现象,纹状体结构正常,细胞间隙未见增宽,胶质细胞未见增生,皮层结构正常,被膜完整,皮质层神经元的细胞结构清晰、排列整齐;与生理盐水组相比,桂枝组海马区、纹状体、皮层结构基本正常,无明显差异;麻黄组可见脑海马区的CA1区有较多的锥体细胞坏死,小胶质细胞增生,纹状体区域可见细胞间中度水肿,组织间隙增宽,胶质细胞明显增生,皮质层神经元细胞排列紊乱,细胞分层模糊,神经元细胞散在分布,可见有神经元细胞坏死,被小胶质细胞吞噬的卫星现象;与麻黄组相比,麻黄-桂枝3:2、3:1组海马、纹状体、皮层病变均有不同情况改善。4.麻黄桂枝配伍对KM小鼠脑组织SOD、MDA、NO、NOS含量的影响与生理盐水组比较,麻黄组脑组织中SOD活力显著降低(P0.01),MDA、NO、TNOS、i NOS含量显著升高(P0.01),桂枝组与生理盐水组差异不明显,无统计学意义(P0.05);与麻黄组比较,麻黄-桂枝3:2组,3:1组SOD活力明显升高(P0.05),MDA、NO、TNOS、i NOS含量明显降低,且具有统计学意义(P0.05)。5.麻黄桂枝配伍对KM小鼠脑组织NLRP3炎症小体表达的影响与生理盐水组比较,麻黄组脑组织中NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白表达显著升高,且具有显著统计学意义(P0.01),桂枝组与生理盐水组差异不明显,无统计学意义(P0.05);与麻黄组比较、麻黄-桂枝3:2组NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白表达显著下降,且具有统计学意义(P0.05),麻黄-桂枝3:1组NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白表达均有不同程度降低,且Caspase-1蛋白表达符合统计学意义(P0.05)。结论1.桂枝与麻黄配伍后能够抑制麻黄对小鼠的中枢兴奋性毒性作用,减少小鼠自主活动,减少小鼠学习记忆功能的错误,改善小鼠脑组织海马、纹状体、皮层病理损伤情况,麻黄与桂枝之间存在“相畏相杀”的配伍关系。2.桂枝可能通过升高多巴胺神经递质DA、DAT含量,增加抗氧化活性,减少氧化应激损伤,抑制NLRP3炎症小体上调从而拮抗麻黄中枢多巴胺神经毒性,且具有一定量效关系,随着桂枝比例的增加,桂枝拮抗麻黄中枢毒性更为显著。
【图文】：
引起的 Ca2+内流增加而发挥神经保护作用[37]。课题组前期采取高效液相色谱-荧光检测法对小鼠大脑皮层氨基酸含量进行测定结果同时表明桂枝配伍麻黄后能升高小鼠脑内 IAA 神经递质 GABA、缬氨酸 (Valine, Val)、丙氨酸 (Alanine, Ala)、酪氨酸 (Tyrosine, Tyr) 含量水平，降低麻黄对氨基酸递质水平含量的不利影响，维持了氨基酸类神经递质的稳态，反映了桂枝杀麻黄，麻黄畏桂枝的配伍关系[24]。5. 研究思路为了进一步探索麻黄中枢神经毒性，本实验以中枢多巴胺神经元损伤为切入点，利用行为学实验分析系统、HE 染色、免疫组化、Western blot 等实验技术，以麻黄、桂枝、麻黄-桂枝药对作为研究对象，，深入研究了麻黄、桂枝以及麻黄-桂枝药对对小鼠大脑中枢多巴胺能神经元的作用以及 NLRP3 炎症小体表达的影响，扩展了麻黄桂枝“相畏相杀”的中枢神经毒性作用机制研究，为提高麻黄临床应用提供一定的实验依据。具体的技术路线图见图 1。
3 实验结果3.1 麻黄桂枝配伍对 KM 小鼠行为学结果的影响3.1.1 麻黄桂枝配伍对 KM 小鼠旷场实验结果的影响表 1-3. 麻黄桂枝配伍对 KM 小鼠旷场实验结果的影响( x s, n＝8)组别 N(只) 剂量(g/kg) 静止 T(s) 运动 T(s) 运动 D(cm)生理盐水组 8 - 158.29±33.74 141.78±33.74 1888.69±664.54麻黄组 8 10 108.43±14.83##191.64±14.84##3947.89±1146.19##麻黄-桂枝 3:2 组 8 10+6.67 139.17±14.31**160.89±14.31**2569.41±621.59*麻黄-桂枝 3:1 组 8 10+3.33 126.50±10.00*173.57±10.00*2882.18±420.61*桂枝组 8 6.67 148.55±14.88**151.54±14.88**1812.43±413.81**注：与生理盐水组比较##P<0.01；与麻黄组比较**P<0.01，*P<0.05
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【参考文献】
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本文编号：
2608915
