基于活体成像的大鼠脑水肿模型评价指标体系的建立及冰片对脂多糖致大鼠脑水肿的改善作用机制研究

发布时间：2020-03-31 10:27

【摘要】：背景脑水肿动物模型是研究临床上各种病因导致脑水肿的重要载体,目前感染性脑水肿动物模型评价指标多采用脂多糖注射制备,检测脑含水量,但需处死动物,或仅检测体温、自主活动,其针对性和可靠性较差,缺乏评价体系。活体成像作为一种无创的形态定量的先进检测手段,尚未被应用到脑水肿动物模型的研究上。著名清凉开窍中药冰片具有抗炎、抗脑水肿等现代药理作用。近年发现,脑血管内皮细胞的网格蛋白与小窝蛋白均参与了脑血管内皮细胞之间的紧密连接蛋白的降解,进而增强了血脑屏障通透性,导致脑水肿发生。这一作用被称为脑血管内皮细胞的内吞作用。但冰片是否能调节内吞作用,是否通过内吞作用而保护血脑屏障,目前尚未见报道。目的基于活体成像建立脂多糖致脑水肿大鼠模型评价指标体系;观察冰片对脂多糖致脑水肿的改善作用机制,是否与保护血脑屏障和抑制脑血管内皮细胞的内吞作用有关。方法1.考察并改良脂多糖致脑水肿大鼠模型的建模方法取雄性SD大鼠,通过考察脂多糖注射剂量(5 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1)、注射方式(尾静脉注射、腹腔注射)、造模时间(6 h、12 h、24 h、36 h)、注射次数(单次、两次、三次)等造模条件,以脑含水量为检测指标,对脂多糖致大鼠脑水肿模型进行优化改良。2.建立基于活体成像的脑水肿大鼠模型评价指标体系的方法观察以下指标,筛选造模成功与否的判定指标依据:采用24小时录像方法记录动物是否有:(1)体毛耸直,精神萎靡;(2)弓背埋头的动作体征;在18 h内观察是否有:(3)腹泻;(4)眼部、口鼻部出血;(5)在0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h时采用大鼠体温计检测体温,绘制体温变化曲线;(6)在18 h采用FX7型活体成像仪检测头部平均荧光强度。2.冰片对脑水肿的改善作用试验动物分组及给药造模18 h后,将造模成功的大鼠随机分为5组:模型组、安宫牛黄丸组、冰片100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、400mg·kg-1组,每组10只,另取正常对照组大鼠10只。造模24 h后,分别灌胃给予相应药物,对照组和模型组灌胃等体积的溶剂0.5%羧甲基纤维素钠,灌胃1 h后取材。3.冰片对脑水肿的作用观察指标及其测定方法灌胃给药30 min后,尾静脉注射2.3 mg·kg-1吲哚菁绿,活体成像观察脑部荧光,计算平均荧光量。灌胃给药1 h后,将动物分为4批分别取材检测:(1)心脏灌流多聚甲醛,取脑,石蜡切片,HE染色,观察其组织形态。(2)心脏灌流2.5%戊二醛,取脑,制备为电镜切片,观察脑微血管周围水肿程度。(3)心脏灌流生理盐水,再灌流4%伊文思蓝(mg/ml)75 ml后灌流生理盐水冲洗,取脑,分左右两半,称湿重:左脑冷冻干燥12 h后称干重,干湿重法计算脑含水量;右脑切碎,按每100 mg脑组织加350μl甲酰胺,56℃浸提12 h,取上清液检测吸光度。(4)取脑组织,以酶联免疫吸附试验测定肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)表达,免疫印迹法测水通道蛋白4(AQP4)、诱导型一氧化氮合酶(i NOS)表达,硝酸还原酶法测定脑一氧化氮(NO)含量。4.冰片对血脑屏障的保护作用观察指标及其测定方法(1)取上述电镜切片,透射电镜观察脑内皮细胞、星形胶质细胞的形态、细胞器、紧密连接完整性。(2)取脑组织,以免疫印迹法测定紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表达。5.冰片对脑血管内皮细胞内吞作用的调节观察指标及其测定方法(1)取上述电镜切片,透射电镜观察脑血管内皮细胞内吞囊泡的数量、体积。(2)取脑组织,以免疫印迹法测定内吞蛋白caveolin 1、CHC、自噬相关蛋白LC3、becline 1、p-Akt、Akt、p-ERK 1/2、ERK 1/2的表达;酶联免疫吸附试验测定p-MEK 1/2、MEK 1/2、MMP-2、MMP-9的表达。结果1.脂多糖致脑水肿大鼠模型改良成功与正常大鼠对照组相比,采用雄性大鼠于0、12 h分两次腹腔注射脂多糖各5 mg·kg-1造模24 h,脑含水量显著升高(P0.05),表明造模成功。2.基于活体成像的脑水肿大鼠模型评价指标体系构建成功经过试验筛选后确定,同时满足下列(1)、(2)、(3)项且满足(4)、(5)、(6)其中任意一项,视为造模成功:(1)体毛耸直,精神萎靡;(2)腹泻;(3)活体成像头部平均荧光强度不低于3800;(4)造模后0.5 h体温高于造模前,3 h体温低于造模前;(5)眼部、口鼻部可见出血;(6)有弓背埋头的动作体征。3.冰片能显著改善脂多糖致大鼠的脑水肿程度(1)脑活体成像荧光强度:与模型组相比,冰片200 mg·kg-1、400 mg·kg-1组大鼠给药后减给药前脑部平均荧光强度差值显著降低(均P0.05)。(2)脑含水量:与模型相相比,冰片400 mg·kg-1组脑含水量显著降低(P0.05)。(3)脑组织形态改变:与模型组相比,冰片组脑水肿程度均有不同程度的改善。(4)血脑屏障通透性:与模型相相比,冰片组脑组织中伊文思蓝含量显著或极显著降低(P0.05,P0.01)。(5)脑水肿的标志性分子指标:与模型相相比,冰片组脑组织中TNF-α、IL-6、AQP4、i NOS、NO含量显著或极显著降低(P0.05,P0.01)。4.冰片能显著保护脂多糖致脑水肿大鼠血脑屏障(1)血脑屏障形态学:与模型组相比,冰片组内皮细胞紧密连接开放程度、星形胶质细胞终足水肿程度减轻。(2)紧密连接蛋白:与模型组相比,冰片组脑组织中claudin-5、occludin、ZO-1含量显著升高(P0.05)。5.冰片能显著抑制脂多糖致脑水肿大鼠脑血管内皮细胞内吞作用(1)内吞囊泡的形态观察:与模型组相比,冰片组内皮细胞内吞囊泡的形成数量减少。(2)内吞蛋白:与模型组相比,冰片组脑组织中caveolin 1含量极显著降低(P0.01),冰片400 mg·kg-1组脑组织中CHC含量显著升高(P0.05)。(3)自噬相关蛋白:与模型组相比,冰片组脑组织中LC3、becline 1含量显著降低(P0.05)。(4)caveolin1—Akt/MEK/ERK—MMP-9通路:与模型组相比,冰片组脑组织中p-Akt/Akt、p-ERK/ERK、p-MEK/MER、MMP-2、MMP-9含量显著或极显著降低(P0.05,P0.01)结论1.改良的脂多糖建模方法模型成功。通过考察脂多糖注射剂量、注射方式、造模时间、注射次数等造模条件,对脂多糖致脑水肿模型进行了优化改良。改良后的造模方法为:雄性SD大鼠,0、12 h各腹腔注射5 mg·kg-1脂多糖24 h后,能成功构建脑水肿模型。该模型不仅脑含水量、血脑屏障通透性以及常规的脑水肿分子指标显著升高,且活体成像脑部平均荧光强度极显著升高,紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1含量显著降低,内吞蛋白caveolin-1、CHC、自噬相关蛋白LC3、becline 1含量显著升高,模型稳定。2.建立了基于活体成像的脑水肿大鼠模型的评价标准。标准如下:(1)体毛耸直,精神萎靡;(2)腹泻;(3)活体成像头部平均荧光强度不低于3800;(4)造模0.5 h体温高于造模前,3 h体温低于造模前;(5)眼部、口鼻部可见出血;(6)有弓背埋头的动作体征。需同时满足(1)、(2)、(3),且满足(4)、(5)、(6)其中任意一项,视为造模成功。3.冰片可显著改善模型大鼠的脑水肿程度。冰片可减轻光镜下、透射电镜下脑水肿程度,显著降低脑含水量、水通道蛋白AQP4的表达,极显著降低TNF-α、IL-6、i NOS的表达,极显著降低脑组织中NO的含量。4.冰片可能通过抑制内吞作用及其下游通路抗脑水肿。冰片可保护血脑屏障结构,上调紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表达,其机制可能与抑制内吞作用、下调内吞蛋白、抑制caveolin 1—Akt/MEK/ERK—MMP-9通路,从而逆转病理条件下紧密连接蛋白降解有关。
【图文】：

示意图,示意图,血脑屏障,过敏反应

图 1-1 血管源性水肿特征示意图Figure 1-1 The schematic of vasogenic edema而炎症反应引起血脑屏障破坏的现象早已被人们发现。早在 1937 年，发现过敏反应可破坏血脑屏障[21]。而在 1956 年，Eckman[22]发现革兰氏内毒素脂多糖能破坏血脑屏障；Allen[23]于 1965 年同样证明了此发现

脑含水量,对照组

图 1-2 不同剂量对脑含水量的影响Figure 1-2 The effect of dosage on brain water content与对照组相比，，*P＜0.05。n=10， ±SD。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5;R-332

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