补肾和脉颗粒干预高龄SHR肾损害的作用机制研究

发布时间：2020-03-31 23:50

【摘要】：目的:本研究以基于补肾和脉理论的组方“补肾和脉方”对高龄自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)进行干预,评估补肾和脉颗粒的降压及肾脏靶器官保护作用;并通过观察其对高龄SHR肾脏血管紧张素II 1型受体(angiotensin II type 1 receptor,AT1)及其下游 3-磷酯酰肌醇激酶,(phosphatidylinositol 3-ki-nase,PI3K)/AKT、RhoA/ROCK通路的影响,从分子水平探讨明确补肾和脉颗粒可能的肾脏作用靶点及其降压的药理机制;并试图应用肾动脉超声多普勒技术评估高龄SHR肾动脉血流参数(主要包括:阻力指数RI、搏动指数PI、血流速度),观测干预前后各项肾动脉血流动力学指标变化,分析其相关意义,以期为“老年高血压病从肾、从络论治”提供“宏观”的血流动力学数据支持;进一步通过观察其对高龄SHR肾脏α-平滑肌肌动蛋白(Smooth muscle actin-α,α-SMA)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)、信号转导蛋白 3(drosophila mothers against decapentaplegic 3,SMAD3)、成纤维细胞特异性蛋白-1(Fibroblast-specific protein-1,FSP-1)的表达改变,评估大鼠肾小球硬化、肾脏纤维化程度,从分子水平探讨补肾和脉颗粒实现靶器官保护、逆转肾脏纤维化的作用机制。方法:1.16月龄雄性SHR大鼠30只,随机数字表法分为模型对照组、西药对照组、补肾和络颗粒组(n=10),以16月龄雄性WKYKyoto大鼠10只和8周龄雄性WKY大鼠10只作为空白对照组。分别给药:补肾和脉颗粒组(补肾和脉颗粒生药浓度生药浓度14.22g.kg-1.d-1)、西药对照组给缬沙坦(14.4mg.kg-1.d-1),模型组和空白对照组给予等量生理盐水灌胃、灌胃体积均为2mL,每天灌胃一次,共计8周。2.补肾和脉颗粒降压及保护肾脏疗效研究:(1)尾动脉加压法每周测量大鼠血压。(2)MindrayM5彩色多普勒超声诊断仪直接接触法扫查测量肾动脉血流参数最大速度(Vp)、最小速度(Vd)、平均流速(Vm)以及阻力指数(RI)、搏动指数(PI)。(3)酶联免疫吸附法(Elisa)8周结束后检测尿中视黄醇结合蛋白(RBP)、尿β2-微球蛋白(β2-MG)、尿半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CystainC)8周结束后,处死大鼠,下腔静脉取血,分离血清,常规化学法检测血清肌酐、尿素氮,酶联免疫吸附法(Elisa)检测血清血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)、血管加压素(Arginine Vasopressin,AVP)、内皮素(Endothelin,ET)等血清学指标改变。(4)分离大鼠肾脏,HE染色及透射电镜观察肾脏及主肾动脉大体病理改变和亚细胞结构变化,免疫组织化学法(IHC)观察肾脏组织中AT1受体、TGF-β受体的分布改变,观察肾脏中血压相关的受体和纤维化相关蛋白的表达与分布情况。3.分子水平探讨明确补肾和脉颗粒可能的肾脏作用靶点及补肾降压的药理机制研究:(1)提取肾脏mRNA和总蛋白,实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR)法分别检测AT1及其下游PI3K、AKT、RhoA、ROCK的mRNA表达改变,Western Blotting法检测了 AKT的蛋白表达,明确该方的降压机制。4.分子水平探讨明确补肾和脉颗粒实现靶器官保护、减轻肾脏纤维化的作用机制研究:分离大鼠肾脏,马松染色观察肾脏及肾动脉(包括主肾动脉、段动脉)胶原沉积情况和纤维化程度。提取肾脏mRNA和总蛋白,实时荧光定量PCR(Q-PCR)法分别检测 α-SMA、CTGF、TGF-β1、SMAD3、FSP-1,Western Blotting 法检测 CTGF、FSP-1、TGF-β的蛋白表达,明确该方减缓肾脏纤维化的作用机制。结果:1.SHR大鼠体重显著低于WKY对照组大鼠(P0.05),其毛色略发黄,精神亢奋,睡眠差;用药后,大鼠一般状况有不同程度的改善,且补肾和脉颗粒组大鼠平均体重略有增加。2.补肾和脉颗粒降压及保护肾脏疗效:(1)治疗8周后,补肾和脉颗粒及缬沙坦组收缩压、舒张压、平均动脉压均明显降低(P0.05)。补肾和脉颗粒组压差明显下降,小于缬沙坦组,而舒张压及平均动脉压高于缬沙坦组。(2)肾脏多普勒超声显示补肾和脉颗粒与西药缬沙坦组肾动脉最大血流速度、最小血流速度增加,RI、PI值均明显低于模型组(P0.05)。(3)给药8周后,Elisa法检测显示补肾和脉颗粒组及西药缬沙坦组尿中RBP、β2-MG、CystainC水平明显低于模型组(P0.05)。(4)常规化学法检测显示补肾和脉颗粒组及西药缬沙坦组血中血清肌酐、尿素氮水平明显低于模型组(P0.05)。(5)Elisa法检测显示补肾和脉颗粒组及西药缬沙坦组血中AngⅡ、AVP、ET水平明显低于模型组(P0.05)。(6)HE染色可见补肾和脉颗粒组及西药缬沙坦组肾小球体积大小适中,系膜区增生较少,系膜基质、胶原纤维增生较少,毛细血管扩张程度较轻,肾间质纤维细胞轻度增生,伴有少量炎细胞浸润,透射电镜示补肾和脉颗粒组及缬沙坦组足突融合明显改善,系膜细胞及间质增生明显减轻,细胞器丰富,线粒体肿胀,可见自噬小体,基底膜结构正常;肾动脉血管细胞排列有序,管壁光滑,中膜平滑肌增厚重塑现象有所减轻。(7)马松染色示:补肾和脉颗粒组及缬沙坦组肾小管、肾间质有少量纤维化沉积,肾小管轻度扩张,肾小囊腔轻度扩张,肾小球轻度纤维增生。(8)免疫组织化学法显示补肾和脉颗粒组及西药缬沙坦组AT1、TGF-β受体表达明显低于模型组(P0.05)。提示补肾和脉颗粒可有效控制血压、保护肾脏。3.补肾和脉颗粒可能的肾脏作用靶点及补肾降压的药理机制研究:荧光定量PCR(Q-PCR)显示补肾和脉颗粒组 PI3K、AKT、RhoA、Rock、α-SMA、CTGF、TGF-β、SMAD3、FSP-1 的 mRNA 表达水平明显低于模型组(P0.05)。Western Blotting法显示补肾和脉颗粒组AKT、CTGF、TGF-β、FSP-1蛋白表达水平明显低于模型组(P0.05)。结论:补肾和脉颗粒可有效控制血压,改善肾脏血流动力学指标,改善SHR肾损害的程度。补肾和脉颗粒通过阻断AT1、TGF-β及PI3K/AKT、RhoA/ROCK通路表达来调节血压,并通过抑制TGF-β/CTGF通路的活化实现靶器官保护及减缓肾脏纤维化。
【图文】：

逦补贤和脉颗粒干预高龄ＳＨＲ肾损害的作用机制研究逦逡逑表３各组大鼠舒张压比较（Ｘ邋士邋ｓ）逡逑组别逦ｎ逦Ｏｗ逦２ｗ逦４ｗ逦６ｗ逦８ｗ逡逑缬沙坦组逦１０逦１３４．２８±６．７４逦１２４．２３±５．３８Ａ逦１１６．２３±５＿４３Ａ逦１１０．９６±５．５３Ａ逦１０２．３３±４．９３Ａ逡逑补肾和脉组逦ｌ0逦１３５．２８±９．６６逦１２６．９１±９．３１逦１２２．６２±８．７３ａ逦１１９．５６±９．９５ａ逦１１４．０４±８．５７ａ逡逑模型组逦１０逦１３６．７４±４．２４＊逦Ｉ３７．１８±５．４６＊逦１３６．４６±４．１６＊逦１３５．７３±６．５６＊逦１３３．８７±５．２７＊逡逑，0邋９２，５±３－５６逦９１７４±３．８４逦％邋施３邋２７逦９Ｕ５±３．２６逦９0．９２土３６３逡逑：且周龄邋ＷＫＹ逦丨邋0逦们遍分逦８６邋３７±８邋３４逦８}0邋６３逦＿土６Ｊ２逦８６，６±８．６７逡逑注：＊与丨６月龄ＷＫＹ组比较，Ｐ＜０．０５；么与５？１１１模型组比较，Ｐ＜０．０５。逡逑

图３各组大鼠平均动脉压比较逡逑注：＊与１６月龄ＷＫＹ组比较，，Ｐ＜０．０５；邋△与ＳＨＲ模型组比较，ＰＣ０．０５。逡逑表５各组大鼠脉压比较（ｘ邋±ｓ）逡逑组别逦ｎ逦Ｏｗ逦２ｗ逦４ｗ逦６ｗ逦８ｗ逡逑缬沙坦组逦１０逦５７．２５士３．０５逦４９．２５士２．５８逦５４．４５±２．７４Ａ逦５３．８９士邋２．６８邋Ａ逦５４．２３士邋２．７６Ａ逡逑补肾和脉组逦１０逦５９．１３邋士邋３．１６逦５５．３６邋士邋２．８０逦５１．７６邋土邋２．６２Ａ逦４８．９８土邋２．３９Ａ逦４８．８９土邋２．３７Ａ逡逑模型组逦１０逦５５．９８士邋２．８２’逦５４．８９土２．７６＊逦５６．４５邋土邋２．８９＊逦５７．５９土３．１５＊逦５９．８９士邋３．２７＊逡逑１邋／－邋ＦＩ逦Ｖ逡逑组，逦，０逦３３．２３±１．７８逦３３．７８±１．９０逦３５．２３±２．？逦３５．}0邋３逦３４．胸５逡逑８邋周龄邋ＷＫＹ邋组邋１０逦２５．１２±１．５６逦２９．８９±１．６４逦２７．２３±１．６２逦３１．２３±１．８８逦２８．２３±１．７３逡逑注：＊与１６月龄ＷＫＹ组比较，ＰＣ０．０５；邋△与５１４１１模型组比较，ＰＣ０．０５。逡逑７０逡逑
【学位授予单位】：山东中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

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本文编号：2609741